В сыворотке и плазме крови человека «Токсоплазма IgG авидность»




Скачать 191.27 Kb.
Дата26.07.2016
Размер191.27 Kb.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВИДНОСТИ АНТИТЕЛ КЛАССАIgG К Toxoplasma gondii В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА



«Токсоплазма IgG авидность»

Только для in vitro диагностики

Toxoplasma gondii относится к простейшим внутриклеточным паразитам, инфицирование которым характеризуется разнообразными клиническими проявлениями. Около 80-90% токсоплазменной инфекции, встречающейся у иммунокомпетентных подростков или взрослых протекает бессимптомно. Клинические симптомы (лимфаденит, лимфоцитоз и миалгия) проявляются в легкой форме. Первичная токсоплазменная инфекция, приобретенная в течение беременности, приводит к врожденному токсоплазмозу с возникновением хориоретинита и повреждений нервной системы. Такие последствия возникают обычно при инфицировании в течение первых 6 месяцев беременности. Диагностика недавно приобретенной (первичной) токсоплазменной инфекции, затруднена тем, что иммуноглобулины М (IgM), типичные маркеры недавней инфекции, могут обнаруживаться в течение многих месяцев и даже лет. Определение авидности специфических IgG оказывается особенно полезным для диагностики первичной инфекции. Имеет значение факт, что первичный IgG иммунный ответ на инфекцию характеризуется антителами с низкой авидностью, которые связываются со специфическим антигенным сайтом, но легко диссоциируют.

ПРИНЦИП АНАЛИЗА

Данная тест-система основана на твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), в котором сыворотки пациентов (вносятся в дубликатах) реагируют с антигеном токсоплазмы, нанесенным на внутреннюю поверхность лунок. После первой инкубации промывают планшет, парные лунки инкубируют с разными буферными растворами, один из которых содержит мочевину. Мочевина вызывает диссоциацию ранее образовавшегося комплекса «антиген – антитело». Степень диссоциации зависит от авидности антител.

После следующего цикла промывки, антитела, связанные с твердой фазой, вступают в последующие реакции, сначала с антителами против IgG человека, меченными пероксидазой хрена, а затем с раствором хромогена (ТМБ). Реакция останавливается добавлением стоп-реагента (HCl). Интенсивность окрашивания раствора измеряется на спектрофотометре при длине волны 450 нм или 405 нм. Соотношение между оптической плотностью в двух лунках рассчитывается и отражает процент авидности.

СОСТАВ НАБОРА

Стрипы с иммобилизованным антигеном токсоплазмы: планшет разборный состоит из 12 стрипов по 8 лунок. Лунки покрыты инактивированным и очищенным антигеном T.gondii.

Низкоавидный контроль: раствор на основе инактивированной сыворотки крови, содержащий низкоавидные антитела класса IgG к токсоплазме — лиофилизованный препарат, представляет собой порошок красного цвета;

Высокоавидный контроль: раствор на основе инактивированной сыворотки крови, содержащий высокоавидные антитела класса IgG к токсоплазме — лиофилизованный препарат, представляет собой порошок синего цвета;

Конъюгат: раствор моноклональных антител к IgG человека, конъюги­рованных с пероксидазой хрена — прозрачная жидкость розового цвета;

Реагент для диссоциации: буферный раствор с мочевиной – бесцветная прозрачная жидкость.

Буферный раствор для промывки лунок (20х): фосфатный буферный раствор - бесцветная прозрачная жидкость.

В случае образования нерастворимых кристаллов поместите флакон с раствором в термостат (37°C) на несколько минут.

Буферный раствор для разведения образцов (20х): раствор на основе сыворотки крови со стабилизаторами –прозрачная жидкость красного цвета.

Раствор ТМБ: раствор тетраметилбензидина – бесцветная или светло-голубого цвета прозрачная жидкость.

Стоп-реагент: 1Н раствор соляной кислоты - бесцветная прозрачная жидкость.

Самоклеющаяся пленка.

Пластиковый пакет.

назначение

Тест-система «Токсоплазма IgG авидность» предназначена для определения авидности антител класса IgG к Toxoplasma gondii в сыворотке крови человека методом «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

1. МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

1.1. Материалы и оборудование, необходимые при работе с набором.

- Микропипетки, в том числе многоканальные, высокой точности (10-200 мкл, менее 3% ошибки).

- Стеклянные или пластиковые пробирки для разведения образцов вместимостью не менее 1 мл.

- Мерный цилиндр объемом 1л.

- Дистиллированная или деионизованная вода.

- Термостат на 37±2°С.

- Автоматическое промывочное устройство.

- Одноволновой или двухволновой спектрофотометр вертикального сканирования с фильтрами на 450нм и 405нм. Если используется двухволновой спектрофотометр, установите референсный фильтр на 600-650нм. Руководствуйтесь инструкцией производителя для определения пределов линейности прибора.

1.2. Автоматический анализатор

Тест-система может быть использована для проведения анализа на автоматическом анализаторе для ИФА на планшетах.

Тест-система адаптирована для работы на RADIM и/или SEAC анализаторах. В случае использования автоматических анализаторов других фирм, необходимо удостовериться, что данный анализатор подходит для проведения ИФА на планшетах.

2. Меры предосторожности

- Для получения достоверных результатов необходимо соблюдать следующие правила:

- Не смешивайте реагенты разных серий. Не смешивайте с реагентами других производителей.

- Не используйте реагенты после истечения срока годности, указанного на упаковке.

- Перед использованием набора доведите все реагенты до комнатной температуры (18...25°С).

- Отбирайте только то количество реагента, которое необходимо для анализа. Во избежание контаминации не возвращайте отобранный реагент обратно во флакон.

- Используйте только дистиллированную или деионизованную воду и только чистую посуду. Избегайте присутствия ионов металла или окисляющих субстанций.

- Не подвергайте реагенты воздействию высокой температуры.

- Избегайте контаминации образцов. Используйте чистые наконечники для каждого образца или реагента.

- Проводите анализ в соответствии с данной инструкцией по применению.

- Восстановление лиофилизованных компонентов проводите в соответствии с указаниями данной инструкции.

- В случае проведения анализа вручную необходимо использовать прошедшее проверку оборудование (автоматические пипетки, автоматическое промывочное устройство, спектрофотометр, термостат).

С целью предосторожности в процессе работы с набором следует соблюдать следующие правила:

- Используйте одноразовые перчатки при проведении анализа и при контакте с потенциально инфекционным материалом.

- Не пипетируйте ртом.

- Стоп-реагент представляет собой 1Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрыз­гивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

- Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В. Были получены отрицательные результаты. Однако так как на сегодняшний день отсутствуют методы, дающие абсолютную гарантию, все исходные материалы следует считать потенциально инфекционными и обращаться с ними в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ 2 группы.

- Избегайте разбрызгивания реагентов. При попадании реагентов на рабочие поверхности тщательно промойте их 3% раствором гипохлорита.

- Некоторые реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может реагировать со свинцом и медью в водопроводных трубах с образованием взрывоопасных соединений. После слива реактивов промойте водой систему, чтобы снизить накопление азидов металлов.

3. СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ

3.1. Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с соблюдением соответствующих мер предосторожности.

3.2. Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови, так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более одной недели или при температуре минус 20°С не более 3месяцев. Не допускается повторное замораживание-размораживание, приво­дящее к искажению результатов. После размораживания образцы следует тщательно перемешать. Перед проведением анализа следует убедиться, что образцы полностью прозрачны. Образцы, содержащие осадок, необходимо очищать центрифугированием при 5–10 тыс. об/мин в течение 10 минут.

Для проведения анализа не следует использовать гемолизированную и мутную сыворотку крови. Не допускается использование образцов с признаками микробной контаминации или с повышенным содержанием липидов.

Перед проведением анализа образцы разводят в отношении 1:300 с помощью предварительно приготовленного буферного раствора для разведения образцов (п.4.5). Например: 10 мкл образца + 2990 мкл буферного раствора для разведения образцов.

4. Подготовка реагентов для анализа

4.1. Упаковку с планшетом перед вскрытием выдерживают в течение 30±2 минут при комнатной температуре (18...25°С). Пакет открывают и переставляют на свободную рамку необходимое количество стрипов.



Хранение: при температуре от 2 до 8°C в течение всего срока годности в пластиковом пакете с герметично закрытым замком (прилагается).

4.2.Содержимое флакона с маркировкой «Низкоавидный контроль» растворяют в 2 мл деионизованной воды, выдерживают при комнатной температуре (18…25°C) в течение 20 минут и тщательно перемешивают, избегая пенообразования. Следует убедиться, что на крышке и стенках флакона не осталось сухого вещества.



Хранение: при температуре от 2 до 8°C в течение 2 месяцев. При необходимости более длительного хранения рекомендуется замораживание при -20°C. Не допускается повторное замораживание-размораживание.

4.3. Содержимое флакона с маркировкой «Высокоавидный контроль» растворяют в 2 мл деионизованной воды, выдерживают при комнатной температуре (18…25°C) в течение 20 минут и тщательно перемешивают, избегая пенообразования. Следует убедиться, что на крышке и стенках флакона не осталось сухого вещества.



Хранение: при температуре от 2 до 8°C в течение 2 месяцев. При необходимости более длительного хранения рекомендуется замораживание при -20°C. Не допускается повторное замораживание-размораживание.

4.4.Перед проведением анализа в стеклянный стакан вместимостью 1000мл вносят содержимое флакона с буферным раствором для промывки лунок (20-кратным) и доводят объем до отметки 1000мл дистиллированной водой. Тщательно перемешивают, избегая пенообразования.



Хранение: Приготовленный буферный раствор для промывки лунок хранить 30 дней при 2-8°C.

4.5.Перед проведением анализа в стеклянный стакан вместимостью 500мл вносят содержимое флакона с буферным раствором для разведения образцов (20-кратным) и доводят объем до отметки 400мл предварительно приготовленным буферным раствором для промывки лунок (п.4.4). Тщательно перемешивают, избегая пенообразования.



Хранение: Приготовленный буферный раствор для разведения образцов хранить 30 дней при 2-8°C.

4.6. Коньюгат, реагент для диссоциации, раствор ТМБ и стоп-реагент готовы к использованию.

4.7. В зависимости от количества образцов приготавливают соответствующее количество реагентов. Перед проведением анализа все реагенты и образцы должны быть тщательно перемешаны и выдержаны при комнатной температуре (18…250С) в течение 30-60 минут.

5. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА*

5.1. Схема проведения анализа приведена на странице 6.

5.2. Составляют протокол маркировки лунок. Лунки маркируют следующим образом:

А1, A2 – № 1 – лунки для определения оптической плотности (ОП) раствора ТМБ;

B1, B2 – № 2 – лунки для определения ОП Низкоавидного контроля;

C1, C2 – № 3 – лунки для определения ОП Высокоавидного контроля;

D1, D2…H11. H12 – № 4 – лунки для определения ОП исследуемых образцов.

5.3. В лунки А1, A2 вносят по 100мкл буферного раствора для разведения образцов.

5.4. Вносят в соответствующие лунки по 100 мкл контролей в дубликатах.

5.5. Вносят в оставшиеся лунки по 100мкл предварительно разведенных (см. п.0.) исследуемых образцов в дубликатах.

Примечание. Общее время внесения калибровочных проб и исследуемых образцов не должно превышать 20 минут, иначе время инкубации различных образцов с иммуносорбентом будет значительно отличаться, что приведет к неправильным результатам.

5.6. В лунки А1, A2 вносят по 100мкл буферного раствора для разведения образцов.

5.7. Накрывают планшет самоклеющейся пленкой и инкубируют стрипы в течение 60±5 минут при температуре 37±2°С.

5.8.По окончании инкубации удаляют содержимое лунок декантированием и промывают лунки четыре раза. При каждой промывке во все лунки добавляют по 350 мкл буферного раствора для промывки лунок, приготовленного по п.4.4, и выдерживают в течение 5–10 секунд с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удаляют остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

5.9. Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устройства.

5.10. Вносят в лунки нечётных рядов планшета (ряды 1, 3, 5, и .т.д.) по 100 мкл буферного раствора для разведения образцов, приготовленного по п.4.5.

5.11. Вносят в лунки чётных рядов планшета (ряды 2, 4, 6 и т.д) по 100 мкл реагента для диссоциации.

5.12. Накрывают планшет самоклеющейся пленкой и инкубируют стрипы в течение 60±5 минут при температуре 37±2°С.

5.13. По окончании второй инкубации удаляют содержимое лунок декантированием и промывают лунки согласно п. 5.8.

5.14. Добавляют во все лунки по 100мкл раствора конъюгата.

5.15. Накрывают планшет самоклеющейся пленкой и инкубируют в течение 30±2 минут при температуре 37±2°С.

5.16. По окончании третьей инкубации удаляют содержимое лунок декантированием и промывают лунки согласно п.5.8.

5.17. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.

5.18. Инкубируют в течение 10 минут при 37±2°C. Следует избегать прямого попадания света на планшет.

5.19. Добавляют во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как раствора ТМБ, по 100мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции. Инкубируют в течение 1–2 минут при комнатной температуре (18…25°C).

5.20. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Референсный фильтр устанавливают на 620 нм, обнуляют прибор по лункам А1, А2. В случае если значение оптической плотности превышает предел линейности спектрофотометра, считывание результатов проводят при 405 нм. Измерение должно проводиться в течение 15 минут после остановки реакции.



* При использовании автоматического анализатора RADIM и/или SEAC, действуйте в соответствии с его инструкцией.

СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

Предварительное разведение образцов 1:300.

Стадия анализа и реагенты

Номер лунок в соответствии с маркировкой по п.5.2

1

2

3

4

А1

A2

B1

B2

C1

C2

Лунки нечётных рядов

Лунки чётных рядов

Низкоавидный контроль, мкл

-

-

100

100

-

-

-

-

Высокоавидный контроль, мкл

-

-

-

-

100

100

-

-

Сх, мкл

-

-

-

-

-

-

100

100

Буферный раствор для разведения образцов, мкл

100

100

-

-

-

-

-

-

Инкубация № 1

60±5 минут, 37±2 °С

4-кратная промывка:
буферный раствор

для промывки лунок, мкл



4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


Буферный раствор для разведения образцов, мкл

100

-

100

-

100

-

100

-

Реагент для диссоциации, мкл

-

100

-

100

-

100

-

100

Инкубация №2

60±5 минут, 37±2 °С

4-кратная промывка:
буферный раствор

для промывки лунок, мкл



4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


Конъюгат, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация № 3

30±2 минут, 37±2 °С

4-кратная промывка:
буферный раствор для

промывки лунок, мкл



4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


4 x

350


Раствор ТМБ, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация № 4

10 минут, 37±2°, темное место

Стоп-реагент, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация № 5

1-2 минуты, КТ

Измерение ОП растворов в лунках стрипов

Спектрофотометр, 450 нм и 405 нм.

Расчет результатов































Примечание: СХ – исследуемые образцы;

ОП – оптическая плотность;

КT – комнатная температура (18…25°С).

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ *

Вычитают среднее значение оптической плотности (ОП) лунок А1, A2 из значений ОП других лунок.

ОП каждого образца, инкубированного с буферным раствором для разведения образцов, должна быть более 0,300. Если ОП менее 0,300, это свидетельствует о том, что образец не содержит достаточную концентрацию IgG антител для определения авидности (пациент не имеет иммунитета к токсоплазме или находится в периоде, когда иммунный ответ еще не сформирован).

Для каждого образца и контроля рассчитывают процент соотношения между ОПД - ОП лунки, инкубированной с реагентом для диссоциации, и ОПР - ОП лунки, инкубированной с буферным раствором для разведения образцов:

ОПД

--------- x 100 = % Авидности

ОПР

Образцы с ОП более 2,000 (предел линейности спектрофотометра), измеренные при 450 нм, подлежат переизмерению при 405 нм. После этого процент авидности рассчитывается согласно п.7.3.

* При использовании автоматических анализаторов RADIM и/или SEAC для планшетного формата считывающий спектрофотометр должен измерять значения автоматически на 3 длинах волн: 450, 405 и 620 нм.

Пример расчета

Образец

ОП Р (450 нм)

ОП Д (450 нм)

% Авидности

Низкоавидный контроль

1.276

0.031

2.4%

Высокоавидный контроль

1.475

0.580

39.3%

Образец

0.766

0.127

16.6%

Критерии достоверности

Оптическая плотность в лунках, содержащих контроли, инкубированные с буферным раствором для разведения образцов, должна быть более 0.500 (450 нм).

Процент авидности должен быть ниже 20% для низкоавидного контроля и выше 30% для высокоавидного контроля.

Интерпретация результатов



% авидности > 30% =

образец содержит высокоавидные антитела класса IgG к T.gondii

% авидности 20-30% =

образец содержит антитела класса IgG к T.gondii неопределенной (средней) авидности – «серая зона»

% авидности < 20% =

образец содержит низкоавидные антитела класса IgG к T.gondii

ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА

Диагностическая специфичность

Диагностическая специфичность данного метода оценивалась на панели клинических образцов сыворотки крови пациентов с прошедшей или повторной инфекцией. Специфичность составляет 90%.

Диагностическая чувствительность

Диагностическая чувствительность данного метода оценивалась на панели образцов с первичной инфекцией. Чувствительность составляет 89%.

Аналитическая специфичность

Аналитическая специфичность определяется, как способность анализа точно выявлять специфический аналит в присутствии интерферирующих факторов в матриксе образца. Контрольные исследования показали, что характеристики анализа не изменяются под действием антикоагулянтов (ЭДТА и гепарин).

Точность


Точность оценивалась на автоматическом анализаторе с помощью определения повторяемости и воспроизводимости анализа (внутри- и межаналитическая вариабельность) на 3 сыворотках с разным % авидности.

Повторяемость (Внутри анализа)

Сыворотка

Значение

±

S.D.

C.V.

Количество




     (Авидность %)

%

репликатов

a

13.9

±

1.6

11.6

10

b

32

±

4

13.4

10

c

52

±

5

10.1

10

Воспроизводимость (Между анализами)

Сыворотка

Значение

±

S.D.

C.V.

Количество




      (Авидность %)

%

репликатов

d

23.9

±

2.9

12

10

e

42.5

±

4.7

11.1

10

f

75.6

±

8.8

11.6

10

Ограничения анализа

Определение высокоавидных антител не исключает возможность недавней инфекции. С другой стороны, это высокоспецифичный тест, положительный результат является строгим индикатором инфекции в предшествующие 3 месяца.

ФОРМА ВЫПУСКА

Тест-систему «Токсоплазма IgG авидность» выпускают в виде набора:



1.

Стрипы с иммобилизованным антигеном токсоплазмы в пакете из пленки цефленовой

1 шт

12стрипов по 8лунок

2.

Низкоавидный контроль

1 фл

Лиофилизованный препарат

3.

Высокоавидный контроль

1 фл.

Лиофилизованный препарат

6.

Реагент для диссоциации

1 фл.

10 мл

7.

Конъюгат

1 фл.

14 мл

8.

Буферный раствор для разведения образцов (20х)

1 фл.

20 мл

9.

Буферный раствор для промывки лунок (20x)

1 фл.

50 мл

10.

Раствор ТМБ

1 фл.

14 мл

11.

Стоп-реагент

1 фл

14 мл

12.

Самоклеющаяся пленка

3 листа

13.

Пластиковый пакет с замком

1 шт.

К набору прилагается:

– инструкция по применению набора реагентов

1 экз.

Набор упакован в картонную коробку.

СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ

Срок годности тест-системы указан на коробке с набором. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Тест-систему хранят в соответствии с СП 3.3.2.1248–03. Хранение осуществляют в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°C. Замораживание не допускается.

Тест-систему транспортируют в соответствии с СП 3.3.2.1248–03. Транспортировку осуществляют всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8°С. Замораживание не допускается.

Литература

Miettinen M, Saxen L, Saxen E (1980) Lymph node toxoplasmosis. Acta Med. Scand. 208:431-436

Couvreur J, Desmonts G (1962) Congenital and maternal toxoplasmosis. A review of 300 congenital cases. Dev. Med. Child Neurol. 4:519-530

Remington JS, Miller MJ, Brownlee I (1968) IgM antibodies in acute toxoplasmosis. II. Prevalence and significance in acquired cases. J. Lab. Clin. Med. 71:855-866

Hedman K, Lappalainen M, Seppala I, Makela O (1989) Recent primary Toxoplasma infection indicated by a low avidity of specific IgG. J. Infect. Dis. 159:736-740

Joynson DHM, Payne RA, Rawal BK (1990) Potencial role of IgG avidity for diagnosing toxoplasmosis. J. Clin. Pathol. 43:1032-1033

Rescaldani R, Vigore L, Vezzo R, Vergani P, Spelta A, Cerruti P (1993) Infection of Toxoplasma and pregnancy: diagnostic value of a new serological assay: avidity-ELISA of specific IgG antibodies. Int. J. Feto-Mat. Med. 6(2):147-153

Lappalainen M, Koskela P, Koskiniemi M, Ammala P, Hiilesmaa V, Teramo K, Raivio KO, Remington JS, Hedman K (1993) Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 167:691-697.


По вопросам поставки набора «Токсоплазма IgG авидность» обращаться по адресу: 357340 г. Лермонтов Ставропольский край, ул. Нагорная д.4А телефон/факс (87935) 3-77-28, 3-74-65 ООО «ВИАР»


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница