Учебное пособие для студентов лечебного факультета Москва 2010




страница1/5
Дата09.07.2016
Размер0.89 Mb.
  1   2   3   4   5
Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра патофизиологии лечебного факультета


Филатов О.Ю., Малышев И.Ю.
клеточные биотехнологии в ИММУНОПАТОЛОГИИ

Учебное пособие для студентов лечебного факультета

Москва 2010


СОДЕРЖАНИЕ стр.




АННОТАЦИЯ

3

Глава1. Полимеразная цепная реакция

4

Глава 2. Моноклональные антитела

11

Глава 3. Химерные, гуманизированные и рекомбинантные антитела

18

Глава 4. Генные вакцины

24

Глава 5. Растительные вакцины

45

Глава 6. Рекомбинантные лекарственные препараты в медицине

51

Глава 7. Эмбриональные стволовые клетки

56

Глава 8. Взрослые стволовые клетки в иммунопатологии

68

Глава 9. Мезенхимальные стволовые клетки

74

Список литературы

80

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ

81

Контроль знаний. Вопросы.

91


Аннотация: Учебное пособие посвящено использованию современных методов клеточных биотехнологий в иммунопатологии, и предназначено для методического обеспечения инновационно-образовательной деятельности медицинского ВУЗа. Учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных сотрудников медицинских ВУЗов. В пособии представлены биотехнологии в иммунологии, которые применяются как в диагностических, так и в лечебных целях. В контексте данной тематики в пособии рассмотрены аспекты молекулярной диагностики инфекций (полимеразная цепная реакция, нанотехнологии, применение моноклональных антител и рекомбинантных антигенов и т.д.). В пособии приведены результаты и перспективные направления использования биотехнологии в лечебных и профилактических целях, и прежде применение рекомбинантных вакцин. Вакцинация остается одним из наиболее значимых достижений медицины последнего столетия. В настоящее время вакцины, оказывающие стимулирующее воздействие на иммунную функцию, рассматриваются не только как средство профилактики и лечения инфекционных болезней, но также и злокачественных новообразований. Рекомбинантные технологии позволяют избежать осложнений, связанных с применением аттенуированных вакцин путем получения определенных белков (или фрагментов белков) патогена, на которые и активируется иммунный ответ. В пособии рассмотрены и различные способы и варианты получения рекомбинантных вакцин, включая векторные вакцины, вакцины растительного происхождения и другие. Кроме того, в пособии отражены методы получения генно-инженерных лекарственных препаратов, содержащих моноклональные антитела (в том числе рецепторов и антагонистов колониестимулирующих факторов; антител, блокирующих фактор некроза опухоли; анти-CD20-антител, вызывающих истощение В-клеточных клонов и др.), а также рекомбинантные альфа-, бета- и гамма-интерфероны. В настоящее время среди наиболее активно разрабатываемых генно-инженерных продуктов находятся препараты группы цитокинов - интерлейкины, а также вещества родственной группы - антагонисты рецепторов интерлейкинов. В качестве продуцентов необходимых белков/пептидов используются различные организмы: от дрожжей до млекопитающих; каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки, описанию которых также уделено внимание в пособии. Заключает пособие глава, посвященная использованию стволовых клеток в иммунопатологии.

  • область применения (факультет, учебный курс): Лечебный факультет и ФПДО; курсы «Патофизиология» и «Клеточные биотехнологии в современной медицине»

  • характер издания (учебник, учебное пособие и др.): рукопись учебного пособия

  • формируемые компетенции (знания, умения и навыки): Теоретические и практические основы использования клеточных биотехнологий в иммуннопатологии

  • объем (печатных листов или др.): 92 стр. формата А4.


Глава1. Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, широко используемый в биологии и медицине, в т. ч. и в иммунологии для диагностики некоторых вирусных инфекций [1]. Значение ПЦР, позволяющего легко и быстро получить огромное количество копий фрагментов ДНК, содержащихся в биоматериале порой в ничтожно малом количестве, трудно переоценить. Почему так важно амлифицировать (т.е. умножать количество) ДНК? Все мы знаем, что каждый живой организм (животное, бактерия, вирус и т.д.) содержит в своем геноме участки ДНК (РНК) с уникальными для данного организма последовательностями нуклеотидов. Таким образом, обнаружив данный уникальный генетический материал, мы можем, по крайней мере, идентифицировать вид живого организма, послужившего его источником. Однако, для того, чтобы провести такой анализ, мы должны располагать достаточно большим количеством анализируемой ДНК (или РНК), а добыть ее в таком количестве из биоматериала далеко не всегда возможно. Вот тут то и приходит на помощь ПЦР. При помощи ферментов, называемых полимеразами (в природе они принимают участие в синтезе молекул ДНК или РНК по соответствующей матрице во время репликации или транскрипции), удается копировать выбранный фрагмент ДНК – первоначально по матрице ДНК, присутствующей в образце (крови, биоптате, соскобах и т.д.), а в последующих циклах по матрице получаемых в предыдущих циклах фрагментов, так что количество фрагментов ДНК, необходимых для анализа, увеличивается в геометрической прогрессии. Отметим впрочем, что рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Для того, чтобы осуществить полимеразную цепную реакцию, мы должны иметь в наличии матричную ДНК или РНК, с которой начнется копирование изучаемого фрагмента (она содержится в анализируемом образце), а также пару одноцепочечных фрагментов ДНК, называемых праймерами. Что такое праймеры? Это короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные участкам ДНК, ограничивающим с двух сторон выбранный фрагмент ДНК (тот, который будет амплифицироваться в ПЦР). Праймеры подбираются так, чтобы связываться комплементарно именно с участками ДНК, ограничивающими наш искомый фрагмент, и никакими другими; чаще всего они синтезируются химическим путем и поэтому их последовательности должны быть четко определены. Зачем нужны праймеры? Все дело в том, что ДНК-полимераза не может начать синтез второй цепочки ДНК без затравки – начального короткого фрагмента второй цепочки, к которому она и присоединяет остальные нуклеотиды один за другим до конца. Вот такой затравкой и служат наши праймеры, с них ДНК-полимераза начинает синтез и они же ограничивают синтезируемый фрагмент, находящийся между ними. Синтез идет с двух комплементарных цепочек ДНК в противоположных направлениях, на каждой цепи – свой праймер.

Один цикл ПЦР, при котором количество генетического материала удваивается, включает три этапа. Первый этап: денатурация двухцепочечной ДНК, т.е. разделение ее на отдельные цепочки, с которыми потом сможет «работать» ДНК-полимераза. Денатурация происходит при нагревании реакционной смеси до 90-96ºС. Второй шаг (называемый отжигом) – комплементарное соединение полученных одноцепочечных молекул ДНК с праймерами при температуре 30-65ºС. Третий шаг – полимеразный синтез второй цепочки ДНК, начинаемый с присоединенных к обеим цепочкам ДНК праймеров, при температуре 65-75 ºС. После того, как мы еще раз повторим этот цикл, количество ДНК снова удвоится и т.д. Один цикл занимает немного времени – всего 1-3 мин., так что за 45 мин мы можем получить миллионы копий одной молекулы (а, точнее, фрагмента) ДНК. (рис.1)

Рис.1 Полимеразная цепная реакция. (По Powledge T.M. The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ. 2004; 28: 47.)
pcr
Несмотря на то, что ПЦР – весьма простой в исполнении метод, в ходе его применения могут возникать разного рода сложности. Первая из них – возможность контаминации исследуемого биологического образца экзогенным генетическим материалом (а для этого достаточно попадания в образец даже нескольких молекул ДНК!), который в результате ПЦР – метода огромной чувствительности - будет также амплифицирован. При таком варианте развития событий полученный результат в лучшем случае посчитают бесполезным и проведут анализ повторно, а в худшем случае такой результат может привести к ошибочному заключению. Поэтому в лабораториях особое внимание уделяется предотвращению контаминации исследуемого материала, особенно фрагментами ДНК, амплифицированными в предыдущих тестах.

Теперь задумаемся о том, каким образом удалось достичь автоматизации процесса ПЦР, заключающейся в том, что нам достаточно поместить в пробирку исследуемый материал, все необходимые реагенты и положить пробирку в амплификатор (прибор, который обеспечивает периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C), после чего, задав необходимые параметры температуры и времени, можно отдыхать порядка 40-50 мин., а потом получить искомый генетический материал в количестве, достаточном для анализа. В первые годы использования метода после каждого цикла (а обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов) приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, поскольку она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для денатурации двухцепочечной спирали ДНК. Это делало процедуру очень неэффективной, требовалось много времени и фермента. В 1986 г. процесс проведения ПЦР был существенно оптимизирован. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз - Taq-полимераза - была выделена из бактерий Thermus aquaticus, обитателей термальных источников, выживающих при температурах, смертельных для других живых организмов. Разумеется, в наши дни Taq-полимеразу, получают уже из генно-инженерных бактерий. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Другие термостабильные полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq-полимеразы. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

Для визуализации результатов амплификации чаще всего применяют метод горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле, в состав которого добавляют специальный краситель ДНК, например, бромистый этидий. При этом, двигаясь с разной скоростью в электрическом поле, фрагменты ДНК разделяются по размеру, образуя характерную картину полосок. Гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм). (рис.2)

Рис.2 Визуализация продукта ПЦР с помощью гель-электрофореза.
pcr_chey_07

Для чего сейчас используют ПЦР в медицине? Первая и важнейшая область применения ПЦР – диагностика инфекций. Метод помогает выявить в биоматериале патогенные микроорганизмы, которые трудно поддаются культивированию или присутствуют в очень малых количествах. К ним относятся различные виды бактерий, грибов и вирусов. Касаемо применения этой методики в иммунологии, можно заметить, что ПЦР позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию быстрее, чем стандартный ELISA-тест (основанный на определении антител) – уже в первые недели после заражения. Второй вариант применения ПЦР в медицине – определение генетических вариаций и мутаций, предрасполагающих или определяющих проявления различных моногенных и комплексных заболеваний. Вообще же ПЦР имеет чрезвычайно широкую сферу использования: в биологии и биотехнологии – для секвенирования ДНК и клонирования генов (с помощью ПЦР амплифицируют нужный ген, который затем можно ввести с помощью вектора в организм-продуцент; так получают многие генно-инженерные белки); в криминалистике – для сравнения генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого (ДНК расщепляют на фрагменты, амплифицируют с помощью ПЦР и затем разделяют фрагменты в геле с помощью электрофореза – «генетический отпечаток пальцев»); для установления отцовства, а также для выявления эволюционного родства среди организмов.




РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ

Полимеразная цепная реакция – это технология умножения (амплификации) генетического материала

  • Один цикл ПЦР, при котором количество генетического материала удваивается, включает три этапа. Первый шаг: денатурация двухцепочечной ДНК. Второй шаг: отжигом. Третий шаг – полимеразный синтез второй цепочки ДНК.

  • Для визуализации результатов амплификации применяют метод горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле

Использование полимеразной цепной реакции

  • В медицине - диагностика инфекций

  • В медицине - определение генетических вариаций и мутаций

  • В медицине - установление отцовства

  • В биологии и биотехнологии – секвенирование ДНК и клонирование генов

  • В биологии –выявление эволюционного родства среди организмов

  • В криминалистике – сравнение генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого





Глава 2. Моноклональные антитела
Моноклональные антитела представляют собой важнейший инструмент в руках иммунолога-исследователя. Применение их в комбинации с такими методами, как эпитопное картирование и молекулярное моделирование, делает возможным составление антигенного профиля и визуализацию макромолекулярной поверхности. Кроме того, мы не можем представить себе современную клиническую лабораторную диагностику без использования моноклональных антител.

Итак, что такое моноклональные антитела? Когда гуморальное звено иммунитета сталкивается с иммуногеном, например, столбнячным токсином, начинается продукция множества антител. Эти антитела различаются между собой, поскольку они специфичны к разным участкам молекулы антигена, называемым также антигенными детерминантами, или эпитопами. В некоторых случаях эпитопы представляют собой непрерывную (линейную) аминокислотную последовательность небольшого размера (чаще всего 6-8 а/к) в структуре белка-антигена, однако часто эпитопы включают в себя аминокислотые остатки, которые в линейной структуре белка отстоят далеко друг от друга, однако сближены в пространстве из-за трехмерной конформации белковой молекулы (так называемые, конформационные эпитопы). Для нас важно понимать, что каждое антитело специфично к одному эпитопу, и что все антитела, связывающиеся с максимальной афинностью с одним и тем же эпитопом есть продукт одного клона В-клеток (понятие специфичности подразумевает связывание антитела с эпитопом антигена с максимальной для данного антитела афинностью, поскольку антитела могут связываться и с другими эпитопами, если они похожи по структуре, но с меньшей афинностью). Таким образом, антитела, специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним В-клеточным клоном называются моноклональными.

В приведенном выше примере столбнячный токсин индуцирует образование целого спектра антител несколькими клонами В-клеток – это поликлональный антительный ответ. Если бы удалось выделить и размножить in vitro один клон В-клеток, то мы получили бы моноклональные антитела. Первой проблемой, вставшей перед учеными на этом пути явилось то, что В-клетки погибали через несколько дней после их изоляции, например, из селезенки мышей. Это повлекло за собой развитие методик иммортализации В-клеток: применялась трансформация клеток вирусами или слияние их с опухолевыми клетками (клетками миеломы), так что получались клеточные гибриды, секретирующие моноклональные антитела – «гибридомы» (рис.3).

Рис.3 Получение гибридом.

image

Итак, каким образом можно получить моноклональные антитела? Имеются рекомбинантные технологии получения антител, которые будут рассмотрены ниже, а сейчас мы проиллюстрируем этот процесс на примере получения мышиных моноклональных антител. Для того, чтобы получить мышиные моноклональные антитела, необходимо пройти 4 стадии: 1) иммунизацию, 2) гибридизацию иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекцию, 3) скрининг, 4) исследование свойств полученных антител и их описание.



Стадия 1. Иммунизация. Иммунизация BALB/с мышей осуществляется тем иммуногеном, к которому необходимо получить антитела, причем обычно в присутствии адьюванта. В качестве иммуногена может выступать белок, целая клетка, пептид достаточной протяженности или короткий пептид, присоединенный к белку-носителю. Белки, как правило, вводятся под кожу, а клетки – внутрибрюшинно. Для получения хорошего иммунного ответа необходимо, чаще всего, несколько инъекций. По прошествии нескольких дней после каждой инъекции у мышей берут кровь и оценивают титр антител при помощи иммуноферментного анализа (для проведения которого, кстати, тоже необходимы моноклональные антитела). Заметим, что проведение повторных иммунизаций способствует переключению типа вырабатываемых антител с IgM на IgG. В подавляющем большинстве случаев желательно получить моноклональные антитела класса IgG, т.к. они менее склонны к деградации и более применимы в качестве терапевтических агентов. В конце концов, выбирается мышь с наиболее активным иммунным ответом, и из ее селезенки или лимфоузлов изолируют В-лимфоциты для последующей гибридизации. Заметим также, что помимо иммунизации in vivo, описанной выше, существует еще возможность иммунизации in vitro, проводимой на культивированных клетках селезенки с минимальным количеством антигена.

Стадия 2. Гибридизация и селекция. Процесс гибридизации заключается в слиянии В-лимфоцитов от иммунизированной мыши с клетками миеломы, происходящем в присутствие полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефектны по ферменту гипоксантингуанинфосфорилрибозилтрансферразе (ГГФРТ), и это их свойство важно для последующей селекции гибридом. Для лучшего понимания этого процесса, заметим, что существует два пути биосинтеза нуклеотидов – путь de novo (проще говоря, с нуля) и альтернативный, осуществляемый как раз с помощью фермента ГГФРТ. Клетки миеломы, не имеющие этого фермента, не могут использовать альтернативный путь. Когда слияние произошло, необходимо удалить оставшиеся миеломные клетки из смешанной культуры, т.к. размножаясь, они могут «вытеснить» гибридомные клетки. Эта селекция производится в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин блокирует de novo путь синтеза нуклеотидов, и миеломные клетки, для которых альтернативного пути нет, погибают, а гибридомы, заполучившие этот фермент от В-лимфоцитов, остаются. Колония гибридомных клеток растет и через 20-30 дней ее начинают культивировать в среде без аминоптерина, т.к. он уже не нужен.

Стадия 3. Скрининг. Теперь, получив гибридомы, мы должны найти и выделить те из них, которые продуцируют антитела нужной специфичности. Вначале тестируют клеточный супернатант на реактивность и специфичность содержащихся в нем антител, для чего применяют ИФА. В некоторых случаях используют иммуноцитохимический анализ. Гибридомы, секретирующие антитела, неспецифичные к данному антигену, стараются выявить и удалисть как можно раньше. Выбранные гибридомы пересаживают в большие по размеру колбы и культивируют, в супернатанте при этом содержатся моноклональные антитела в концентрации, как правило, от 1 до 60 мкмоль/мл. Получаемые таким образом антитела замораживают и хранят до тех пор, пока они не понадобятся.

Стадия 4. Анализ моноклональных антител. За всеми вышеописанными действиями следует исследование реактивности, специфичности и кросс-реактивности получаемых антител. Необходимо определить изотип секретируемых антител от каждой полученной гибридомы. Поскольку, как правило, мы имеем несколько стабильных позитивных гибридом, образовавшихся при слиянии различных В-лимфоцитов с миеломными клетками, мы располагаем целой коллекцией моноклональных антител к данному антигену различного изотипа (к примеру, IgG1, IgG2a, IgG2b и т.д.). Антитела тестируются также на связывание с антигеном в условиях различных систем анализа. Это важно особенно в тех случаях, если антитела будут применяться в диагностических целях, поскольку в разных диагностических системах они могут вести себя по-разному, ведь при использовании некоторых технологий эпитопы антигена могут быть маскированы, разрушены или стать недоступными для антител в результате иммобилизации. Моноклональные антитела могут быть специфичны к нескольким эпитопам, поэтому проводят также эпитопное картирование, т.е. выявление тех последовательностей аминокислот, с которыми может связаться антитело. Каждое антитело с помощью ИФА тестируется на связывание с пептидами длиной порядка 10-20 а/к, перекрывающими всю структуру белка-антигена. Если антитела не связываются ни с одним пептидом, то, вероятно, они специфичны к конформационным эпитопам. Для анализа антигенных детерминант таких антител применяют конкурентный ИФА [2]. Дальнейшая характеристика свойств антител может включать анализ аффинности их связывания с антигеном например, с помощью, поверхностного плазмонного резонанса (ППР). ППР – это оптический биосенсорный метод, позволяющий проводить наблюдения в реальном режиме времени, что позволяет не только регистрировать взаимодействие молекул, но и оценивать кинетические характеристики этого процесса Лазерный пучок света, проходящий через призму, падает на поверхность, покрытую золотом. Свет отражается от поверхности по всем направлениям за исключением критического угла. Лазерный пучок в этом направлении возбуждает плазмонную волну на поверхности металла, что и вызывает падение интенсивности отраженного света. Величина критического угла строго зависит от коэффициента преломления слоя, прилегающего к поверхности сенсора. Таким образом, оценивая изменения критического угла с течением времени, можно определить изменения, происходящие на поверхности сенсора (рис 4).

Рис.4 Поверхностный плазмонный резонанс.

spr

После того, как моноклональные антитела получены и охарактеризованы, они могут применяться в различных целях. Как правило, цели эти – научно-исследовательские (например, эпитопное картирование антигена) или диагностические (диагностика инфекций, гистопатологическая диагностика аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей и т.д.). Применение мышиных антител с лечебной целью затруднено, хотя они и могут быть эффективны, поскольку эти антитела являются чужеродными для иммунной системы человека и могут вызвать на себя иммунный ответ. Чтобы этого избежать, существуют способы создания химерных антител, с мышиным Fab-доменом и человеческим Fc-доменом.





  • РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ

    Моноклональные антитела – это антитела, специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним В-клеточным клоном называются моноклональными

    Получение моноклональныех антител:

    1) иммунизация,

    2) получение клеток миеломы,

    3) гибридизация иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекция,

    4)скрининг и исследование свойств полученных антител.

    Анализ аффинности моноклональных антител поверхностным плазмонным резонансом (ППР).

    Применение моноклональных антител


    • В научных исследованиях

    • В диагностике

    • В терапии




  1   2   3   4   5


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница