Сравнительная оценка методов заготовки, обработки и клинического применения концентратов тромбоцитов. 14. 01. 21-гематология и переливание крови



страница1/2
Дата14.08.2016
Размер0.5 Mb.
ТипАвтореферат диссертации
  1   2

На правах рукописи

КАРПОВА

Оксана Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ЗАГОТОВКИ, ОБРАБОТКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ ТРОМБОЦИТОВ.

14.01.21-гематология и переливание крови

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2014


Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович

доктор медицинских наук Трахтман Павел Евгеньевич
Официальные оппоненты:

Голенков Анатолий Константинович- доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Н.Ф.Владимирского.

Жибурт Евгений Борисович – доктор медицинских наук, профессор, заслуженный рационализатор РФ, проректор по научно-организационной работе Института усовершенствования врачей Национального медико-хирургического центра имени Н.И.Пирогова.
Ведущая организация:

Федеральное Государственное бюджетное учреждение Гематологический Научный Центр Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: РФ Москва,125167, Новый Зыковский проезд, д.4


Защита состоится « » __________ 2014 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117198, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России и на сайте www.niidg.ru
Автореферат разослан« » __________ 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Чернов Вениамин Михайлович



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Сегодня трансфузии аллогенных КТ имеют важное значение для детей с онкогематологическими заболеваниями для профилактики или купирования геморрагического синдрома, развившегося вследствие тромбоцитопении или тромбоцитопатии при различных заболеваниях кроветворной системы или миелотоксического воздействия цитостатиков и/или лучевой терапии (А.Г.Румянцев, В.А. Аграненко 2002). Интенсивность и агрессивность современных протоколов химиотерапии, широкое внедрение технологий трансплантации гемопоэтических стволовых клеток делают донорский концентрат тромбоцитов самым востребованным компонентом крови.

Необходимо оптимизировать и совершенствовать технологии заготовки, обработки компонентов крови для обеспечения максимально качественной гемотрансфузионной поддержки (Филатов Ф. П. и др. 2001; Донсков С. И. и др. 2001).

Актуальными проблемами безопасности трансфузий на сегодня являются:



  1. Количество тестируемых патогенов ограничено только вирусами гепатитов В и С, ВИЧ.

  2. Риск бактериальной контаминации концентратов тромбоцитов.

  3. «Слабые места» скрининг-тестирования: период «серонегативного окна» и ограниченность чувствительности тест-систем.

  4. Отсутствие скрининговых тест-систем для новых патогенов.

  5. Риск развития негемолитических (фебрильных) трансфузионных реакций, связанных с аллогенными донорскими лейкоцитами и белками плазмы.

На сегодняшний день указанные проблемы не решены окончательно, поэтому необходимо использовать максимально все возможности для сведения посттрансфузионных рисков к минимуму.

Для решения этих задач существует стандартный комплекс мероприятий: совершенствование методов отбора доноров, технологий двухэтапного лабораторного скрининга (серологический скрининг+ тестирование нуклеиновых кислот (NAT), способов заготовки компонентов крови (приоритет аферезным технологиям с применением лейкоредукции), бактериальное тестирование, архивация донорских образцов, выполнение программы по карантинизации плазмы. Но, серологические методы и тестирование нуклеиновых кислот (NAT) снижают, но не исключают вероятность передачи стандартных тестируемых патогенов (Hogman C. F.1976).

Также возрастает риск передачи патогенов, на наличие которых не проводится скрининг донорской крови. В 2009 году Комитет по заболеваниям, передаваемым при переливании крови Американской ассоциации банков крови определил 68 новых патогенов с подтвержденным или потенциальным риском передачи при переливании компонентов крови (Stramer S. et. al. 2009). В качестве приоритетных для тестирования были определены следующие патогены: вирус лихорадки Денге и Babesia spp, вирус Чикунгуньи, Leishmania spp, Plasmodia spp, Trypanosomacruzi, парвовирус В19, аденовирус человека 5 типа, вирус гриппа Н1N1.

Распространение новых патогенов связано с естественной миграцией вирусов из тропических стран в страны с умеренным климатом. Это связано и с увеличением путешественников по всему миру, и с климатическими переменами (Sharm S. P. 2010; Rezza G. et al. 2007; Zheng К. et al. 2010; Rasongles P.et al. 2009).

Еще больший риск трансфузионной передачи патогенов возникает в результате потенциальной бактериальной контаминации концентрата тромбоцитов (КТ), что связано с погрешностями заготовки (погрешность обработки локтевого сгиба, ошибки при венепункции, повторная венепункция, отсутствие отвода первой порции крови в контейнер-спутник) (Corash L. et al. 2011) и с комнатной температурой хранения КТ (Corash L. 2000).

Скрининг КТ на наличие бактерий не дает 100% гарантию безопасности гемотрансфузий (Kleinman S. еt al. 2012). Доказано, что частота передачи бактериальной инфекции даже после проведения скрининга составляет 1 на 1500 КТ (Murphy W. G. et al. 2008). Учитывая, что средний взрослый пациент с онокгематологическим заболеванием получает 6 КТ за один цикл химиотерапии, то риск передачи бактериальной инфекции при гемотрансфузиях возрастает до 1:250.

Актуальной проблемой остается не только инфекционная, но и иммунологическая безопасность гемотрансфузионной терапии (Абдулкадыров К. М. и др.; Глазанова Т.В. и др. 2011). Неинфекционные (иммунологические) трансфузионные осложнения связаны с присутствием в компонентах крови жизнеспособных аллогенных лейкоцитов, не смотря на внедрение фильтрации донорской крови. К ним относятся: лихорадочные негемолитические реакции, острое поражение легких связанное с переливанием (ТРАЛИ), аллоиммунизация к лейкоцитарным антигенам, формирование рефрактерности к трансфузиям КТ, болезнь «трансплантат против хозяина» (Pelszynski M. M. et al. 1994; Seftel M. D. et al. 2004; Rebulla P. 2005; Geiger T. L. et al. 2007; Hendrickson J. E. et al. 2009).

Поэтому на сегодняшний день очень актуален поиск оптимальных способов заготовки и методов обработки компонентов крови, чтобы максимально минимизировать риск посттрансфузионных реакций. Особенно важен этот вопрос в отношении больных с иммунодепрессией (Morel P. C. 1999; Mc Cullough J. 2007).

Заготовку аферезных КТ с пониженным содержанием плазмы можно рассматривать как один из способов заготовки компонентов крови с целью уменьшения частоты трансфузионных реакций, связанных с биологически активными компонентами плазмы (deWildt-Eggen J. et al. 2000; Аzuma H. et al. 2009; Fontana S. et al. 2011; Marschner S. et al. 2011).

В последнее десятилетие на фоне роста числа заместительных трансфузий все больший интерес представляет заготовка КТ с применением добавочных растворов (ДР) с целью снижения вероятности развития негемолитических посттрансфузионных реакций. Кроме того, использование добавочных растворов при заготовке КТ способствует сохранению функциональной активности тромбоцитов при длительных сроках хранения (Murphy M. F. et al. 1991; Seghatchian J. et al. 2001; Procházková R. еt al. 2007; Tynngard N. et al. 2012).

Для максимального уменьшения инфекционных рисков целесообразно внедрение различных технологий инактивации патогенов (ИП) и донорских лейкоцитов (с применением ультрафиолета (УФ) в сочетании с фотосенсибилизатором) в клеточных компонентах крови (синонимы: инактивация патогенов, вирусинактивация). Современные технологии ИП позволяют в короткие сроки получать КТ, свободными от патогенов (вирусов, бактерий, простейших), тем самым обезопасив реципиента от возможных трансфузионных осложнений. В отличие от бактериальной детекции, эффективные технологии ИП могут значительно снизить риск пролиферации минимального уровня бактерий при хранении (Ruane P. H., et al. 2004; Goodrich R. P. et al. 2006; Cardo L. J. et al. 2007; Rentas F.et al. 2007; Goodrich R. P. et al. 2009).

Основной принцип различных технологий инактивациии патогенов и аллогенных лейкоцитов заключается в воздействии на нуклеиновые кислоты. Идеальные технологии ИП должны обеспечивать не только максимальное снижение патогенной нагрузки на компонент крови и инактивацию аллогенных лейкоцитов, но и обеспечивать максимальную сохранность клеток и белков крови.

Сама процедура заготовки, процессинга и хранения тромбоцитов, а также способы обработки КТ приводят к выраженным изменениям их морфологических и функциональных характеристик, что в свою очередь ведет к снижению терапевтической эффективности трансфузионной терапии (Holme S. 1998; Seghatchian J. 2006). Необходимо всесторонне оценить не только морфо-функциональные характеристики клеток, но и клиническую эффективность концентратов тромбоцитов, заготовленных и обработанных разными методами.
Цель исследования - оценить на разных сроках хранения качество КТ (in vitro и in vivo), заготовленных и обработанных разными способами и их клиническую эффективность для оптимизации гемотрансфузионной терапии в педиатрии.
Задачи исследования:


  1. Оценить морфологические и метаболические характеристики концентратов тромбоцитов на разных сроках хранения, заготовленных разными способами.

  2. Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения, заготовленных разными способами.

  1. Оценить морфологические характеристики концентратов тромбоцитов на разных сроках хранения, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.

  2. Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.

  3. Изучить эффективность рентгеновского (Rg)-облучения для инактивации остаточных лимфоцитов в КТ и необходимость Rg - облучения в технологической цепи обработки КТ.

  4. Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний КТ, заготовленных разными способами.

  5. Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний КТ, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.


Научная новизна:

В отличие от существующих стандартных методов заготовки АКТ был впервые применен автоматический метод получения АКТ на аппарате Trima Accel с пониженным содержанием плазмы с применением добавочного раствора SSP+. Новая методика афереза КТ позволяет эффективно использовать компоненты крови в педиатрической практике с целью снижения вероятности развития негемолитических посттрансфузионных осложнений у пациентов (за счет уменьшения биоактивных компонентов плазмы) на фоне роста числа заместительных трансфузий.

Впервые в России проведен сравнительный анализ морфофункциональных и биохимических параметров клеток в КТ, заготовленных на платформе Trima Accel по методике с применением добавочного раствора. Показатели качества клеток in vitro указывают на оптимальное качество тромбоцитов в течение всего периода хранения, независимо от способа заготовки АКТ. По морфофункциональным и биохимическим параметрам КТ, заготовленные в ДР, характеризуются менее интенсивными процессами гликолиза; по антигенной структуре отличаются более низким уровнем спонтанной и индуцированной экспрессии маркеров активации и апоптоза. Доказана необходимость внедрения новой методики процессинга АКТ в ДР в педиатрической практике с целью решения задачи максимального сохранения жизнеспособности тромбоцитов в процессе заготовки и хранения.

Впервые была проведена сравнительная оценка изменений морфологических и активационных параметров тромбоцитов (заготовленных разными способами) при обработке АКТ по технологии инактивации патогенов ИП с применением УФ+РФ и Rg-облучением в дозе 25 Гр. Следствием воздействия на тромбоциты УФ+РФ является изменение морфофункциональных показателей тромбоцитов к концу срока хранения и увеличение активации тромбоцитов с запуском процессов апоптоза в течение хранения. При этом Rg-облучение не оказывает отрицательного влияния на тромбоциты, что подтверждается данными исследования in vitro.

Впервые в педиатрической практике было изучено клиническое применение АКТ, заготовленных разными способами и обработанных УФ+РФ, и проведен сравнительный анализ данных. Доказано, что клиническая эффективность КТ, заготовленных в плазме и КТ в ДР равнозначна по таким показателям, как АПТ и СПТ, но при оценке количества неэффективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений, более эффективными оказались КТ, заготовленные в ДР. Выявлена корреляция между результатами in vitro и in vivo и доказано уменьшение клинической эффективности КТ, обработанных ИП с применением УФ+РФ.
Научно-практическая значимость работы:

Полученные результаты позволяют считать заготовку КТ с добавочным раствором приоритетным способом заготовки КТ в педиатрической практике. Данные по сравнению клинической эффективности разных КТ, позволяют выработать правильную стратегию по заготовке и обработке компонентов крови, для оптимизации гемостатической терапии для пациентов с онокгематологическими заболеваниями.


Результаты работы были доложены и опубликованы:

1. Игнатова А.А, Карпова О.В., Трахтман П.Е., Пантелеев М.А. Оценка качества аферезного концентрата тромбоцитов, заготовленного с использованием добавочного раствора SSP+. материалы II конгресса гематологов Pоссии, 17-19 апреля 2014г. Москва // гематология и трансфузиология. 2014. т.59, №1, с.96

2. Карпова О.В., Ройтман Е.В., Колесникова И.М., Трахтман П.Е., Румянцев С.А. «Изменения функциоанальных показателей тромбоцитов при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных разными методами». Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 24-25 июня 2014г, г. Санкт-Петербург.

3. Карпова О.В. Изменение функциональных показателей тромбоцитов при хранении концентратов тромбоцитов, заготовленных разными методами. Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы и перспективы развития службы крови Республики Казахстан», 10-11 сентября 2014 г., г. Алмата, Казахстан.

4. Eugene V. Roitman, Irina M. Kolesnikova, Oksana V Karpova, Pavel E. Trakhtman, Sergey A. Roumiantsev. Changes in clot properties due to platelet concentrate storage (in vitro study) // abstr. of 2ndeuplan conference, 24-26 september, Le bischenberg, France. European platelet Network, 2014.vol. 126.p 110

5. Колесникова И.М., Ройтман Е.В., Карпова О.В., Трахтман П.Е., Румянцев С.А. «Факторы, влияющие на изменения гемостатических свойств тромбоконцентратов при хранении», ХIV съезд федерации анестезиологов и реаниматологов, Казань, 20-22 сентябрь 2014 C.156-157

6. И. М. Колесникова, Е.В.Ройтман, О.В. Карпова. Гемостатические свойства тромбоцитных концентратов при хранении// Гемостаз, проблемы и достижения, 10-13 октября, Ереван, Армения. Научно-практический журнал «Кровь», 2014. №2, с 80.

7. Карпова О.В. «Сравнительная характеристика концентратов тромбоцитов, заготовленных и обработанных разными методами». Научно-практическая конференция «Производственная и клиническая эффективность концентратов тромбоцитов плазмы, инактивированных амотосаленом и ультрафиолетовым облучением», Санкт-Петербург 11-12.11.2014г.



8. Eugene Roitman, Irina Kolesnikova, Oksana Karpova, Sergey Roumiantsev Subsequent clot properties depend on the storage time of platelet concentrates // Cith abstract submission. Bleeding disorders.cith 2014-abs-1056 Berlin Germany October 30-November 1 2014

9. О.В. Карпова, Е.В.Ройтман, А.А. Игнатова, С.Р. Мадзаев, С.А. Румянцев,

С.А. Плясунова, П.Е. Трахтман. Оценка качества тромбоцитного концентрата,

заготовленного методом афереза с использованием добавочного раствора SSP+ Журнал «Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2014.»-№2(13)-С.20-24.

10. О.В. Карпова, Е.В. Ройтман, И.М. Колесникова, П.Е. Трахтман, М.Ю. Андрианова, А.М. Исаева, С.А. Румянцев. Метаболические изменения при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных разными методами. – Журнал «Трансфузиология» 2014 -№3(15)-С. 30-32.

11. Е. В. Ройтман, И. М. Колесникова, О. В. Карпова. Изменения гемостатических свойств сгустка при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных различными методами.- Журнал «Гематология и трансфузиология» №3 2014-С. 30-34.

12.?????

13.??????

Апробация работы состоялась 10.10.2014г на заседании научного совета в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» МЗ РФ.

По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей (4- в журналах ВАК) и 8 тезисов, 2 из которых в иностранных изданиях

Структура и объем диссертации:

Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 25 рисунками. Представлены ссылки на 176 литературных источника (16 отечественных, 160 зарубежных).



Содержание работы

Работа выполнена в _________


Материалы и методы исследования

Получение АКТ:

КТ были получены стандартизировано от здоровых доноров методом афереза на сепараторе для автоматизированного сбора крови и ее компонентов Trima Accel (Caridian BCT, США).

Заготовка концентратов тромбоцитов была проведена двумя способами: классический – в 100% плазме и с плазмозамещающим раствором SSP+ (Макофарма, Франция). ДР добавляли сразу (с помощью коннектора) по окончанию процедуры афереза в расчете на такой конечный объем КТ, чтобы выполнялось условие не менее 40 мл общего объема на 0,6х1011 клеток. При этом соотношение донорской плазмы и ДР составляло 1:3 (30% донорской плазмы и 70% ДР). Общая характеристика КТ:

КТ, заготовленные в плазме (n=28): ср. объем КТ 444±102 мл; средняя концентрация тромбоцитов составила (6,6±1,5)x1011.

КТ, заготовленные с ДР (n=29): ср. объем КТ до добавления ДР составил 131±25,8; после добавления- 437±86мл; средняя концентрация тромбоцитов составила (6,5±1,3)×1011.

Средняя концентрация тромбоцитов при заготовке в обеих группах КТ составила 6,85×1011, средний объем КТ – 458,46 мл.

Все заготовленные КТ были автоматически лейкоредуцированы (с помощью камеры лейкоредукции LRS),c обязательным последующим лабораторным контролем на проточном цитометре). Все КТ, участвовавшие в исследовании, содержали лейкоциты менее 1×106.

При исследовании образцов КТ, обработанных разными методами, разделение исходного КТ проводилось по следующей схеме (табл.1).

Таблица 1

Схема разделения АКТ, заготовленных разными способами, для последующей обработки разными методами

KT-Плазма

KT-ДР

Объем-570 мл

Объем 610 мл

Количество тромбоцитов 8,5×1011

Количество тромбоцитов 8,5×1011

КТ-К

КТ-Rg

КТ-М

КТ-К

КТ-Rg

КТ-М

105 мл

80 мл

360 мл

105 мл

80 мл

450 мл

1,55×1011

1,1×1011

5,4×1011

1,55×1011

1,1×1011

6,3×1011

КТ-К- не подвергалась никакой обработке, контрольная группа.

КТ-Rg- подвергалась рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.

КТ-М- подвергалась обработке по инактивации патогенов.

Вирусинактивация КТ проводилась с помощью технологии PRT–система Mirasol (Caridian), основанная на сочетанном использовании рибофлавина и УФ-B–250-350 нм. Вирусинактивация КТ проводилась строго согласно инструкции производителя, соблюдая требования по технологии сбора КТ, по срокам обработки, объему КТ и концентрации тромбоцитов (перед добавлением рибофлавина).

Rg-облучение КТ проводили в день заготовки не позднее двух часов после заготовки на рентгеновском аппарате «АРДОК -1» (Россия).

КТ хранились в интегрированных полимерных контейнерах производства компании Terumo BCT, соответствующих требованиям спецификации, в течении 5-и дней со дня заготовки при температуре +20-24 °С в термостате при постоянном помешивании.

КТ обеих групп были разделены на две равные части (общее количество тромбоцитов на один гемоконтейнер не должно превышать 5,1×1011 – по условиям от производителя).

Отбор проб (по 3 мл) КТ проводили в стерильных условиях через 2 часа после афереза (1час- фаза покоя, КТ находился вне шейкера, комнатная температура хранения (для спонтанной дезагрегации) и 1 час в термостате при температуре +20-24°С при постоянном перемешивании)– на 0-й день, 1-й, 3-й и 5-й дни хранения.

Для оценки функциональной активности CD3+ (обработанных и необработанных) клеток определяли митогенный ответ методом серийных разведений (МСР) путем выделения МКПК (в градиенте Ficoll-Hypague), получения CD3-обедненной фракции методом негативной иммунномагнитной селекции (Miltenyi Biotec, Калифорния) с последующим гамма-облучением в дозе 30 Гр; выделения CD3+ положительной фракции методом позитивной иммунномагнитной селекции с последующим приготовлением серийных разведений для необработанных клеток: разведения 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 и 0,625 клеток/на объем лунки), и для клеток, подвергнутых гамма-облучению или ИП разведения: - 1х105, 3,3х104, 1,1х104, 3700, 1200, 410, 140 и 46 клеток/на объем лунки).

Используемая среда содержала: 16% эмбриональная телячья сыворотка (FCS Atlanta Biologicals, Атланта, штат Джорджия), 8 мг/мл ФГА-М (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), 50 ед/мл рекомбинантный IL-2 человека (Zeptometrix, Буффало, штат Нью-Йорк), 10% стимулятор роста Т-клеток (TCGF, Zeptometrix).

В лунки 96-луночного планшета вносили фидерные клетки (1х105 клеток на объем лунки), а затем добавляли обработанные и необработанные (контрольные) Т-клетки. Опыты с каждым разведением были воспроизведены в 12 лунках; поставлен контрольный эксперимент при отсутствии Т-клеток в системе.

На 3-й, 7-й, 14-й дни в каждую лунку вводили 25 мл питательной среды, содержащей 45% FCS, 45% TCGF, 500 U/мл рекомбинантного человеческого IL-2, 80мг/мл PHA-M. Для предотвращения испарения все планшеты накрывались специальной водонепроницаемой и CO2 проницаемой пленкой и инкубировались при температуре 37 °С. На 21-й день проводилась микроскопическая оценка розеткообразования. Положительным результатом оценки пролиферации клеток в каждой лунке считалось наличие хотя бы одной розетки под микроскопом.

Для оценки клинической эффективности трансфузий в исследование были включены трансфузии КТ, заготовленных и обработанных разными способами, пациентам с тромбоцитопенией менее 20х109л. Оценивали трансфузии КТ пациентам с геморрагическим синдромом по шкале ВОЗ менее 2 баллов (петехии, синяки на коже, подслизистые гематомы, гематурия, мелена, кровохарканье, маточное кровотечение (более двух прокладок в сутки), носовое кровотечение (продолжительностью более часа), но не требующее трансфузий эритроцитов, и у которых отсутствовали состояния, связанные с повышенным потреблением тромбоцитов (инфекция, лихорадка, спленомегалия, ДВС и др). Проанализировали клинико-лабораторные показатели эффективности трансфузий: абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) и скорректированный прирост тромбоцитов (СПТ) через 24 часа после трансфузии, продолжительность межтрансфузионных интервалов, а также эффективность трансфузий и количество посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных в 100% плазме, с добавочным раствором не-/обработанных по технологии патогенной редукции. Неэффективными трансфузиями считались те переливания КТ, когда АПТ был равен или ниже ноля, отсутствовал гемостатический эффект и пациенту требовалась повторная трансфузия КТ для купирования геморрагического синдрома.

Всего было проанализировано 814 трансфузий КТ, из них: КТ-Плазма - 387 ед.; КТ-ДР-257 ед.; КТ-Плазма, обработанные ИП - 70 ед.; КТ-ДР, обработанные ИП -100 ед.

Подсчет количества тромбоцитов в исследуемых образцах проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex KX-21 путем разведения образца буферным раствором в соотношении 1: 10 после предварительного перемешивания образца на программируемом ротаторе-миксере BioSan MultiBioRS-24 (BioSan, Латвия).

Подсчет количества остаточных лейкоцитов в концентрате тромбоцитов проводили на проточном цитометре FACS Canto IIс применением наборов Kit TruCount Fluorospheres фирмы «Becton Dickinson» (определение антител против панлейкоцитарного маркера CD45).

Для оценки электролитного состава и кислотно-щелочного состояния КТ использовался прибор POC-анализатор iSTAT (Abbot Laboratories Inc., США; Сервис Инструмент Плюс, Россия - картриджи CHEM8+ и CG4+.)

Методика исследования КТ методом проточной цитометрии:

Образцы КТ разбавляли в 40 раз буфером А (150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,4 мМ NaH2PO4, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,5 % бычий сывороточный альбумин, pH 7,4) с добавлением 5 мМ CaCl2. В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р-селектина, фосфатидилсерина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии на AccuriC6 (BD Biosciences, USA) с помощью флуоресцентно меченых антител PE-CD62P (Bioscience, USA), FITC-PAC-1 (BDBiosciences, USA) и Alexa 647-annexinV (Biolegend, USA).

Для активации тромбоцитов (при исследовании маркеров активации в каждой из групп при разделении КТ на три равные части: контрольная группа - КТ, группа, облученная Rg-КТ-Rg; группа, обработанная по системе ИП-КТ-М) в пробы вносили аналог коллагена CRP (collagen related peptide) до конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию проводили в течение 15 минут, после чего в пробы добавляли флуоресцентно меченные антитела и инкубировали еще 5 мин. Затем пробы разбавляли в 20 раз буфером А с 2,5 мМ CaCl2 и анализировали на проточном цитометре по характерному светорассеянию и флуоресценции связавшихся на поверхности тромбоцитов антител.

Анализ полученных результатов проводили при помощи специализированного программного обеспечения CFlowPlus. Границы популяции тромбоцитов определяли по характерному светорассеянию. Далее только для выделенной зоны тромбоцитов анализировали флуоресценцию связавшихся на их поверхности антител. За 100 % принимали число всех событий в популяции тромбоцитов. Процент фосфатидилсерин-положительных определяли как отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных аннексином V, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов. Процент Р-селектин - положительных определяли как отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных CD62P, к количеству всех событий в популяции тромбоцитов.

Статистический анализ проводили с помощью программного пакета Origin 8.0 (OriginLabCorp., USA). Значения показателей в группах представлены средними значениями (М ± SD). Для оценки различий между значениями показателей в группах применяли тест Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р< 0,05.

Вычисление частоты событий (ответ на стимуляцию-розеткообразование) в исследовании методом серийных разведений рассчитывали по анализу си-квадратов на основании распределения Пуассона. Для распределения Пуассона можно утверждать, что 37% ячеек в среднем отрицательны, если один конкретный лейкоцит попадал в каждую лунку в самом начале. Уменьшение логарифма Т-клеток может быть рассчитано следующим образом (fконтроль/fобработка), гдеfконтроль – это частотность Т-клеток в контрольных клетках, а fобработка – это частотность Т-клеток в ИП – обработанных или гамма-облученных клетках.


Каталог: documents -> 10156
10156 -> Методические рекомендации по вопросам представления сведений о доходах, расходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера и заполнения соответствующей формы справки (прилагаются)
10156 -> Биоимпедансометрия и антропометрия в комплексной оценке нутритивного статуса у детей с онкологическими и неонкологическими заболеваниями в раннем периоде после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток 14
10156 -> Памятка населению по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний, передающихся через почву, на территориях, подвергшихся подтоплению
10156 -> Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва- 2014 Список использованных сокращений
10156 -> Национальный медико-хирургический центр имени н. И. Пирогова
10156 -> О ситуации с лихорадкой Эбола (по состоянию на 20. 10. 2014)


Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница