Производные бензимидазола модуляторы рецепторов биологически активных веществ 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология




страница2/3
Дата14.08.2016
Размер0.7 Mb.
1   2   3

Результаты исследования и их обсуждение.

В результате исследований in vitro 136-ти соединений, конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, выявлены вещества, модулирующие ответ, опосредованный мембранными рецепторами биологически активных веществ, как G-ПСР (гистаминовыми Н1, Н2 и Н3, серотониновыми 5-НТ2 и пуриновыми Р2Y1), так и ионотропными (серотониновыми 5-НТ3) рецепторами.

При исследовании влияния на физиологический ответ, связанный со стимуляцией гистаминовых Н1-рецепторов было обнаружено, что 81% от общего количества исследованных веществ ингибируют спазмолитический эффект гистамина на изолированной подвздошной кишке морской свинки. При этом 8% наиболее активных соединений, несмотря на выраженную антигистаминную активность в концентрации 10-5М, при исследовании дозозависимого эффекта оказались в среднем на 2 порядка слабее эталонного Н1-антагониста дифенгидрамина. Однако, у исследуемых веществ разница показателей рА10 и рА2, характеризующая характер антагонизма к данному подтипу рецепторов, составила от 1,02 до 1,08, а у дифенгидрамина - 1,04, что свидетельствует о конкурентном характере антагонизма производных бензимидазола к гистаминовым Н1-рецепторам. При анализе взаимосвязи химической структуры исследованных соединений, и проявленной ими Н1-антагонистической активности, был обнаружено, что наиболее активными являются N9-замещенные ИМБИ и, кроме того, абсолютно у всех высоко активных веществ в положении С2 гетероциклического ядра имеется галогензамещенный (моно или дизамещенный) фенил.

Дальнейшее исследование корреляционных зависимостей между физико-химическими параметрами молекул исследуемых веществ и уровнем Н1-антагонистических свойств (табл.1) обнаружило умеренную положительную корреляцию с геометрическими параметрами радикала в положении С2 (r=0,33, p=0,02), степенью его липофильности (r=0,41, p=0,003), а также с величиной максимального положительного заряда гетероциклического ядра (r=0,33, p=0,021), что дает еще один аргумент в пользу предположения об участии С2 заместителя и гетероциклического ядра в молекулах ИМБИ во взаимодействии с Н1-рецептором. При этом, заместитель у С2 будет участвовать в гидрофобных взаимодействиях, а гетероциклическое ядро, вероятно, в электростатическом взаимодействии за счет протонированного третичного атома азота в 1-м или 9-м положении.

QSAR-анализ веществ, проявляющих данный вид активности, выявил в качестве наиболее значимых фрагментов (табл.2) углеродную цепочку с третичной аминогруппой, ароматические фрагменты и атомы хлора или брома, также соединенные с ароматическими фрагментами.

При анализе формул производных бензимидазольных систем легко заметить, что эти соединения содержат в своей структуре один или два имидазольных цикла (входящих в структуру гистамина), а также один или два «классических» фармакофора H1-антигистаминной активности. Следует также отметить, что трициклические бензимидазолы являются π-амфотерными гетаренами, а ранее было показано, что величины общей π-избыточности и ее распределение по циклам конденсированных гетероароматических систем имеют важное значение для проявления биологической активности гетероциклических соединений (Пожарский А.Ф., 1985).

Таблица 1

КОРРЕЛЯЦИОННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ РЕЦЕПТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИССЛЕДОВАННЫХ ВЕЩЕСТВ И ИХ ЛИПОФИЛЬНОСТЬЮ (LogP), МОЛЕКУЛЯРНОЙ РЕФРАКЦИЕЙ (MR) И ПАРЦИАЛЬНЫМИ МАКСИМАЛЬНЫМИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ И ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ ЗАРЯДАМИ (Qmax+, Qmax-) (r – коэфф. корреляции, р – уровень значимости)




Параметр

Н1-

антагонизм

Н2-

антагонизм

Н3-

агонизм

5-НТ2-

антагонизм

5-НТ3-антагонизм

P2Y1-

антагонизм

r

p

r

p

r

p

r

p

r

p

r

p

LogP

0,22

0,126

0,48*

0,009

-0,48*

0,008

0,07

0,561

0,06

0,600

-0,10

0,492

LogPЯ

-0,09

0,530

0,16

0,397

0,05

0,795

-0,26*

0,024

-0,15

0,198

0,24

0,092

LogPR’

-0,14

0,404

0,04

0,866

-0,56*

0,011

0,44*

0,013

-0,09

0,573

0,01

1,000

LogPR’’

0,39

0,145

0,06

0,873

-0,43

0,250

0,04

0,799

0,04

0,855

-0,30

0,201

LogPR’’’

0,41*

0,003

0,55*

0,002

-0,28

0,135

0,07

0,547

0,17

0,177

-0,17

0,255

LogPR””

-

-

-

-

-

-

0,62*

0,017

0,24

0,339

-

-

MR

0,10

0,484

-0,08

0,691

-0,19

0,357

0,02

0,897

0,03

0,801

0,24

0,098

MRЯ

-0,11

0,444

-0,03

0,873

0,06

0,760

0,27*

0,017

0,39*

0,001

-0,55*

0,001

MRR’

-0,01

0,948

-0,01

0,957

-0,47*

0,036

0,44*

0,013

0,42*

0,004

0,00

1,000

MRR’’

0,35

0,196

0,05

0,889

-0,43

0,250

0,31

0,072

0,28

0,240

-0,34

0,146

MRR’’’

0,33*

0,020

-0,03

0,864

-0,19

0,335

0,12

0,345

0,16

0,192

-0,13

0,389

MRR””

-

-

-

-

-

-

0,15

0,598

-0,07

0,794

-

-

Qmax+

0,35*

0,013

-0,06

0,773

0,01

0,981

0,01

0,941

0,03

0,796

-0,10

0,514

Qmax-

-0,19

0,188

0,32

0,101

-0,59*

0,001

0,06

0,582

-0,07

0,565

0,07

0,641

Продолжение таблицы 1



Параметр

Н1-

антагонизм

Н2-

антагонизм

Н3-

агонизм

5-НТ2-

антагонизм

5-НТ3-антагонизм

P2Y1-

антагонизм

r

p

r

p

r

p

r

p

r

p

r

p

Qmax+Я

0,33*

0,021

0,05

0,811

-0,23

0,229

0,06

0,634

0,34*

0,005

-0,06

0,662

Qmax-Я

0,14

0,342

-0,33

0,091

0,15

0,443

0,13

0,259

0,04

0,773

0,10

0,497

Qmax+R’

0,02

0,886

0,33

0,162

0,27

0,248

-0,29

0,109

0,30*

0,038

-0,05

0,808

Qmax-R’

0,19

0,265

-0,05

0,845

0,24

0,314

0,04

0,831

-0,30*

0,042

0,12

0,524

Qmax+R”

-0,37

0,215

-0,65

0,083

0,46

0,247

0,03

0,868

0,28

0,375

-0,42*

0,047

Qmax-R”

-0,33

0,266

-0,90*

0,002

0,46

0,247

-0,19

0,286

0,36

0,251

0,05

0,836

Qmax+R”’

0,17

0,241

-0,32

0,106

0,14

0,479

0,01

0,971

-0,06

0,642

0,11

0,456

Qmax-R”’

0,22

0,128

0,36

0,069

-0,11

0,602

-0,06

0,672

0,12

0,369

-0,08

0,630

Qmax+R””

-

-

-

-

-

-

-0,82*

0,001

-0,41

0,098

-

-

Qmax-R””

-

-

-

-

-

-

-0,17

0,554

0,27

0,287

-

-

* - модуль коэффициента корреляцииr   0,25 при статистической значимости р 0,05
Примечание: подстрочные индексы означают, что расчет параметра производился для отдельного структурного фрагмента: Я – гетероциклическое ядро; R’, R”, R”’, R”” – радикалы по отдельности

Таблица 2

ФАРМАКОФОРЫ РЕЦЕПТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА


Вид рецепторной активности

Фармакофорные группы

Н­1-антагонистическая




Н­2-антагонистическая




Н3-агонистическая




5-НТ2-антагонистическая




5-НТ3-антагонистическая




Р2Y1-антагонистическая




На основании QSAR-анализа производных бензимидазола, можно выдвинуть такие предположения относительно их вероятного специфического механизма H1-антигистаминного действия. Взаимодействие конденсированных производных бензимидазола с H1-гистаминовым рецептором, возможно, обеспечивается в точке π-связывания рецептора за счет полициклической ароматической системы, дополнительно – за счет электростатического взаимодействия частично отрицательно заряженного азота алкиламинного фрагмента с другой точкой связывания H1-рецептора с одновременной конформационной адаптацией гибкой алкильной цепочки к молекулярному полю рецептора, и, кроме этого – за счет комбинированного электростатического и π-взаимодействия галогенарильной группы с третьей точкой связывания сайта H1-рецептора.

При исследовании влияния производных бензимидазола на эффекты, связанные со стимуляцией гистаминовых Н2-рецепторов у 83% веществ было выявлено ингибирующее влияние на положительный хронотропный эффект селективного агониста гистаминовых Н2-рецепторов, при этом лишь одно вещество было по величине соответствующей активности эквивалентно эталонному препарату циметидину, и одно – было активнее в 2,5 раза. разница показателей рА10 и рА2, характеризующая характер антагонизма к данному подтипу рецепторов, составила 1,24 и 1,05, соответственно, что можно расценивать как показатель конкурентности проявляемого Н2-антагонизма. В целом, наиболее активные вещества, как и в случае Н1-антагонистической активности, относились к N9-ИМБИ, а также N4-замещенным триазоло[1,5-а]бензимидазола и, кроме того, у всех высоко активных веществ в положении С2 гетероциклического ядра имеется незамещенный фенильный радикал.

При сопоставлении отдельных физико-химических свойств и уровня Н2-антагонистической активности (табл.1) была обнаружена умеренная положительная корреляция (r=0,55, p=0,002) со степенью липофильности радикала в положении С2 гетероциклического ядра, что также как и в случае с Н1-антагонистической активностью, может свидетельствовать о гидрофобных взаимодействиях между этим радикалом и соответствующими фрагментами молекулы Н2-рецептора. Кроме того, достаточно ярко подтвердилась в целом низкая активность N1-ИМБИ: выявлена высокая отрицательная корреляция (r=0,9, p=0,002) с уровнем максимального отрицательного заряда на радикале у атома N1, что позволяет предположить, электростатическое взаимодействие веществ, несущих большой отрицательный заряд на данном радикале, с одноименно отрицательно заряженными структурами рецепторной молекулы, что приводит к взаимному отталкиванию.

Дальнейший QSAR-анализ веществ, проявляющих данный вид активности, также как и в случае Н1-антагонистических свойств, выявил в качестве наиболее значимых фрагментов (табл.2) углеродную цепочку с третичной аминогруппой и, кроме того – иминогруппу в сочетании с ароматическими структурами, в том числе и как компонент пятичленного гетероароматического, в том числе и имидазольного цикла.

Вероятно, взаимодействие конденсированных производных бензимидазола с сайтом связывания H2-гистаминового рецептора обеспечивает прежде всего внешний 5-членный имидазольный цикл полициклической гетероароматической системы, а также электронодонорная гетероатомная группа, в частности аминогруппа, за счет донорно-акцепторных и/или водородных связей. Возможно, дополнительную стабилизацию основного взаимодействия обеспечивает бензольное кольцо в 2-положении трицикла.

При исследовании влияния производных бензимидазола на эффекты, опосредованные гистаминовыми Н3-рецепторами в условиях in vitro на изолированной тощей кишке морской свинки, выяснилось, что изучаемые соединения демонстрируют активность однонаправленную с селективным гистаминовым Н3-агонистом R-(-)--метилгистамином, то есть, проявляют Н3-агонистические свойства различной степени выраженности, но ни одно из них не оказывает Н3-гистаминоблокирующего действия. Ни одно из семи производных бензимидазола, продемонстрировавших Н3-агонистическую активность, по уровню активности не превышало стандартный Н3-агонист. Однако, если рассматривать сам факт наличия Н3-агонистической активности в ряду исследованных соединений, она оказалась максимальной у морфолиноэтилзамещенных трициклических производных бензимидазола в не зависимости от типа гетероциклического ядра.

Выявленная умеренная отрицательная корреляция (r=-0,47, p=0,036) (табл.1) между уровнем Н3-агонистической активности и геометрическими параметрами радикала у атома N9 может свидетельствовать о возможных пространственных затруднениях для молекул, имеющих большой размер заместителя у 9-го атома азота гетероциклического ядра, при позиционировании молекулы в рецепторном кармане. Подобная же корреляция (r=-0,56, p=0,011) со степенью липофильности радикала у N9 гетероциклического ядра может указывать на то, что для проявления Н3-агонистической активности, гидрофобные взаимодействия между лигандом и рецепторной молекулой препятствуют функциональной активации гистаминового Н3-рецептора.

Сравнительный QSAR-анализ выявил наличие лишь одного достоверного структурного соответствия (табл.2) - иминогруппы в составе ароматической системы, в том числе и в составе имидазольного цикла.

Учитывая полученные результаты, можно сделать некоторые выводы относительно вероятного специфического механизма H3-агонистического действия конденсированных производных бензимидазола.

Взаимодействие конденсированных производных бензимидазола с сайтом связывания H3-гистаминового рецептора обеспечивает прежде всего внешний 5-членный цикл полициклической гетероароматической системы; при этом основными в детерминации H3-агонистической активности являются электронные характеристики этого цикла (в том числе, величина π-избыточности), которые должны максимально соответствовать имидазолу гистамина – в трициклических бензимидазолах такое соответствие обеспечивается 2-фенильным заместителем, уменьшающим π-избыточность внешнего пятичленного гетарила.

В серии экспериментов по изучению влияния производных бензимидазола на биологические эффекты опосредованный серотониновыми 5-НТ2-рецепторами было выявлено, что у 66 % от общего количества исследованных веществ на модели активации тромбоцитов кролика, индуцированной селективным 5-НТ2-агонистом -метил-5-НТ, проявляется ингибирующий эффект. При этом лишь у одного соединения в исследуемой концентрации 10-7М данный эффект превышает таковой у эталонного препарата – селективного 5-НТ2-антагониста - кетансерина.

В результате анализа взаимосвязи химической структуры исследованных соединений, и проявленной ими антисеротониновой активности, показано, что наиболее активными 5-НТ2-антагонистами оказались N9-пиперидиноэтил замещенные ИМБИ.

При этом обнаружена высокая отрицательная корреляция (r=-0,81, p=0,001) (табл.1) соответствующей активности с максимальным положительным зарядом радикала у атома С3 гетероциклического ядра в сочетании с умеренной положительной корреляционной зависимостью (r=0,62, р=0,017) от липофильности этого же заместителя, что может свидетельствовать, что электростатическое взаимодействие с одноименно заряженными структурами рецепторной молекулы приводит к затруднению позиционирования молекулы вещества в рецепторном кармане, и, кроме того, о возможности гидрофобного взаимодействия радикала в данном положении с фрагментами рецепторной молекулы. Положительная умеренная корреляция (r=0,44, p=0,013) с липофильностью заместителя у 9-го атома азота гетероциклического ядра показывает, что радикал в данном положении может участвовать в формировании гидрофобных взаимодействий с рецепторной молекулой.

Результаты QSAR-исследования указывают (табл.2), так же как и в случае с Н1- и Н2-антагонистами, на значимость углеродной цепочки с третичной аминогруппой, в том числе и соединенной с ароматической системой, а также, как в случае с Н2- и Н3-лигандами, пятичленный карбо- или гетероароматический цикл.

Как и в случае лигандов рецепторов других биогенных аминов, углеродная цепочка с третичной аминогруппой, является одним из характерных признаков данных веществ.

Вероятно, дополнительное связывание конденсированных производных бензимидазола с 5-HТ2-рецептором серотонина, обеспечивается в гидрофобном рецепторном кармане за счет π-π взаимодействий полициклического ароматического ядра и/или ароматических радикалов с ароматическими аминокислотными остаткам ТМ VI и VII рецепторной макромолекулы (Roth B.L. et al., 1997; Kristiansen K. et al., 2000; Shapiro D.A. et al., 2000).

При исследовании влияния на биологические эффекты, связанные со стимуляцией серотониновых 5-НТ3-рецепторов, было обнаружено, что 66% от общего количества исследованных веществ уменьшают положительный хронотропный эффект серотонина на изолированном атропинизированном предсердии морских свинок. При этом при этом у 13-ти субстанций (18%) активность превышала таковую у препарата сравнения – селективных 5-НТ3-антагонистов – MDL 72222 и трописетрона. При этом, самое активное вещество под лабораторным шифром РУ-63 приблизительно в 3 раза превосходило по величине ингибирующего эффекта препарат сравнения MDL 72222 (бемесетрон). Разница показателей рА10 и рА2, характеризующая характер антагонизма к данному подтипу рецепторов, для наиболее активных веществ составила от 2,39 до 2,86, что свидетельствует о неконкурентном характере антагонизма исследованных производных бензимидазола к серотониновым 5-НТ3-рецепторам.

В целом, среди изученных типов производных, наибольший 5-НТ3-антагонистический эффект присущ N9-ИМБИ с 9-диалкиламино- и 9-пиперидиноэтильным заместителями.

При поиске возможных корреляционных зависимостей между уровнем 5-НТ3-антагонистической активности исследованных производных бензимидазола и их физико-химическими свойствами (табл.1) наибольшего внимания заслуживает умеренная положительная корреляция с максимальным положительным зарядом гетероциклического ядра (r=0,34, р=0,005), сочетание положительной корреляции с максимальным положительным зарядом радикала в положении N9 (r=0,30, р=0,038) и отрицательной – с максимальным отрицательным зарядом этого же радикала (r=-0,30, р=0,042), которые могут свидетельствовать о том, что взаимодействие веществ изученной группы с 5-НТ3-рецептором, по всей видимости, осуществляется за счет электростатических взаимодействий с несколькими точками рецепторного сайта. В этом, скорее всего, участвуют протонированный третичный атом азота в 1–м или 9-м положении гетероциклического ядра и также протонированный атом азота алкиламинной цепи в положении N9.

QSAR-анализ лигандов данного рецепторного типа выявил (табл. 2) высокую значимость третичной аминогруппы и ароматических систем, причем в наиболее ярких случаях, как сочетание в виде третичной аминогруппы (возможно в составе цикла) и оксигруппы ароматической системы, соединенных сопряженной углеродной цепочкой.

Относительно выявленного неконкурентного характера антагонизма производных бензимидазола к данному подтипу рецепторов, хотелось бы добавить следующее наблюдение, обнаруживаемое другими исследователями. В частности, результаты экспериментов по докингу 5-НТ3-лигандов показывают, что молекулам антагонистов не обязательно целиком заходить в карман связывания. Они могут блокировать лишь подход к данному месту или вызывать аллостерические изменения при связывании с удаленными участками 5-НТ3-рецепторной молекулы, в то время как молекуле серотонина, для функциональной активации ионного канала необходимо позиционироваться в рецепторном кармане целиком (Thompson A.J. et al. 2005).

При исследовании влияния производных бензимидазола на эффекты, связанные со стимуляцией пуриновых Р2Y1-рецепторов у 73% веществ было выявлено ингибирующее влияние на процесс активации тромбоцитов кролика в безкальциевой среде, при этом у 8-ми соединений уровень соответствующей активности был выше, чем у эталонного вещества Basilen Blue. В целом, наибольшая активность, в отличие от всех вышеописанных случаев исследования влияния на аминергические рецепторы, более характерна для морфолиноалкил замещенных производных, но в наибольшей степени дериватам N1-ИМБИ.

Исследование корреляционных зависимостей между некоторыми физико-химическими параметрами молекул исследуемых веществ и уровнем Р2Y1-антагонистических свойств (табл.1) была обнаружена отрицательная корреляция умеренной степени выраженности с величиной молекулярной рефракции гетероциклического ядра (r=-0,55, p=0,001), что может отражать пространственные затруднения, которые могут возникать у молекул, имеющих большой размер при позиционировании в рецепторном кармане, и также негативная корреляция с максимальным положительным зарядом на N1-радикале (r=-0,42, p=0,047), свидетельствующая о возможных электростатических несоответствиях фрагментов молекулы лиганда и функциональных групп молекулы рецептора в точках возможного взаимодействия.

QSAR-исследование выявило (табл.2), что основными структурными соответствиями в данном случае являются оксо- или оксигруппа и ароматические системы.

Немногочисленные доступные литературные данные так же не указывают на роль азотсодержащих групп в связывании лигандов с Р2Y1-рецептором. Напротив, в связывании лиганда участвуют в первую очередь положительно заряженные аминокислотные остатки в ТМ III, ТМ IV и ТМ VII. К ним относятся аргинин в положениях 128 и 310, а также серин 314 (Jiang Q. et al., 1997).


Фармакологические свойства производного бензимидазола с Н2-антагонистической активностью – соединения РУ-64.

Данные, полученные при in vitro исследовании Н2-гистаминоблокирующей активности в рядах производных бензимидазола, свидетельствуют о целесообразности дальнейшего фармакологического изучения наиболее активного соединения под лабораторным шифром РУ-64.

Величина рА2 Н2-антагонистической активности соединения РУ-64 составляет 7,75, что соответствует концентрации 1,78×10-8М, а у препарата сравнения циметидина - 7,30, что соответствует концентрации 5,01×10-8М. При изучении острой токсичности соединения РУ-64 на белых лабораторных мышах показатель ЛД50 при внутрибрюшинном введении составил 150,5 мг/кг, в то время как ЛД50 циметидина (в/бр) - 306 мг/кг (Bruseghini L.et al., 1983). Таким образом, условный терапевтический индекс (LD50,мг/кг/EC50,C(M)/10-8) для исследуемого вещества составляет 85, а для препарата сравнения – 61. Таким образом, данные соотношения свидетельствуют о преимуществах соединения РУ-64 перед препаратом сравнения не только по уровню специфической фармакологической активности, но и по возможной безопасности его применения.

При 14-часовом лигировании привратника у крыс, ЕД50 антисекреторного действия составило для соединения РУ-64 - 17,8 мг/кг, а для циметидина - 63,1 мг/кг. Сопоставляя величины ЕД50 можно сделать вывод, что изучаемое вещество по ингибированию секреции соляной кислоты в 3,5 раза сильнее циметидина.

При непрерывной перфузии желудка крыс (рис.1) соединение РУ-64 так же продемонстрировало дозозависимый антисекреторный эффект. При этом в дозе 30 мг/кг снижало уровень базальной кислотопродукции в 1,6 раз сильнее, чем циметидин, и достоверно не отличалось от фамотидина, в тех же дозах. По влиянию на уровень активности пепсина, исследуемое вещество в 4 раза превосходило циметидин и в 1,4 раза – фамотидин.

Уровень секреции кислоты стимулированной гистамином (рис.1) соединение РУ-64 снижало в 6 раз сильнее, чем циметидин, и практически не уступало фамотидину при введении веществ в дозах 30 мг/кг. По влиянию на активность пепсина на данной экспериментальной модели РУ-64 было в 2,7 раз эффективнее, чем циметидин и равно фамотидину.

Пентагастрин-стимулированную секрецию кислоты (рис.1) соединение РУ-64 снижало в 7 раз сильнее, чем циметидин и практически не уступало фамотидину, при введении веществ в дозах 30 мг/кг. По влиянию на активность пепсина на данной экспериментальной модели его действие было сходно с фамотидином и в 4 раза эффективнее, чем циметидин.


Базальная

секреция


Гистамин-стимулированная

секреция


Пентагастрин-стимулированная

секреция
Рис. 1. Влияние соединения РУ-64 и препаратов сравнения в дозах 30 мг/кг (при внутрижелудочном введении) на базальную, гистамин- и пентагастрин-стимулированную желудочную секрецию крыс.


При изучении длительности антисекреторной активности соединения РУ-64 при пероральном введении на модели 7-ми часового лигирования привратника обнаружено, что длительность антисекреторного эффекта составляла 8 часов, при максимуме действия – через 4 часа после введения.

Вещество под лабораторным шифром РУ-64 дозозависимо подавляло образование эрозивных повреждений СОЖ крыс, вызванных индометацином, этанолом и преднизолоном, гистамином, серотонином, при 14-ти часовой перевязке привратника и введением аммиака на фоне ишемии. Величины ЕД50 гастропротективного действия РУ-64 и препаратов сравнения представлены в таблице 3.

По уровню гастропротективной активности соединение РУ-64 на использованных экспериментальных моделях в 5-26 раз превосходит циметидин и в 1,5-2 раза – фамотидин.

Таблица 3.

ВЕЛИЧИНЫ ЕД50 ГАСТРОПРОТЕКТИВНОГО ЭФФЕКТА СОЕДИНЕНИЯ РУ-64 И ПРЕПАРАТОВ СРАВНЕНИЯ НА РАЗЛИЧНЫХ МОДЕЛЯХ ЭРОЗИВНО-ЯЗВЕННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ


Тип эрозивно-язвенных повреждений

ЕД50, мг/кг

РУ-64

Циметидин

Фамотидин

Индометациновый

7,9

114,6

-

Этанол-преднизолоновый

4,5

116,7

8,1

Гистаминовый

9,2

88,2

7,1

Серотониновый

16,9

79,8

15,2

14-ти часовое лигирование привратника

8,0

80,6

11,5

Геликобактероподобный

13,5

-

21,8

Длительность гастропротективного эффекта, изученная на модели 7-ми часового лигирования привратника желудка крыс также составила 8 часов с достижением максимума через 1 час после перорального введения.

Анализируя эффективность соединения РУ-64 при язвообразовании различного генеза обращает на себя внимание тот факт, что на моделях повреждений СОЖ, где основным патогенетическим механизмом является нарушение синтеза простагландинов, таких как НПВС-индуцированные, этанол-преднизолоновые, а также при повреждениях, индуцированных аммиаком, данное вещество демонстрирует значительно большую активность по сравнению с циметидином и фамотидином, чем при других экспериментальных моделях язв.

Это свидетельствует в пользу того, что помимо снижения активности агрессивных факторов желудочного содержимого за счет антагонизма к гистаминовым Н2-рецепторам, вещество РУ-64 влияет на факторы защиты СОЖ, проявляя выраженную гастропротективную активность.

При разработке на основе фармакологически активных веществ новых лекарственных препаратов важное место занимают фармакокинетические исследования (Жердев В.П. и др., 1995). В результате проведенных экспериментов были определены основные фармакокинетические параметры соединения РУ-64 (табл.4), что может служить основанием для разработки оптимальной лекарственной формы для изучаемого вещества.

Таблица 4.

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СОЕДИНЕНИЯ РУ-64 В КРОВИ КРЫС ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ В ДОЗЕ 10 мг/кг


Параметры

Плазма

AUC, мг*час/л

17,98

Kel, час

0,39

T1/2, час

1,76

Cmax, мкг/мл

12,75

Tmax, час

0,083

MRT, час

3,00

Cl, л/(час*кг)

0,56

Vd, л/кг

1,41

Vss, л/кг

1,67


Фармакологические свойства производного бензимидазола с 5-НТ3-антагонистической активностью – соединения РУ-63.

Данные, полученные при in vitro исследовании 5-НТ3-блокирующей активности в рядах производных бензимидазола, позволили считать целесообразным дальнейшее фармакологическое изучение наиболее активного соединения под лабораторным шифром РУ-63.

Величина рА2 5-НT3-антагонистической активности соединения РУ-63 составляет 9,89, что соответствует концентрации 1,29×10-10М, а у препарата сравнения MDL 72222 - 9,61, что соответствует концентрации 2,46×10-10М. При изучении острой токсичности соединения РУ-63 на белых лабораторных мышах показатель ЛД50 при внутрибрюшинном введении составил 115,5 мг/кг, в то время как ЛД50 эталонного вещества MDL 72222 (бемесетрона) (в/бр) - 32,0 мг/кг (US Patent Document., Vol. #4563465). Таким образом, условный терапевтический индекс (LD50,мг/кг/EC50,C(M)/10-10) для исследуемого вещества РУ-63 составляет 89, а для препарата сравнения лишь 13. Таким образом, по соотношению токсичность/активность соединение РУ-63 в 7 раз превосходит эталонный препарат.

Основной областью применения блокаторов 5-НТ3-серотониновых рецепторов является тошнота и рвота, возникающие во время химиотерапии цитостатиками (Egerer G. et al., 2000). В исследованиях, проведенных в условиях in vivo на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак, соединение РУ-63 удлиняло латентный период возникновения первого приступа рвоты и достоверно снижало общее количество рвотных приступов в 4,3 раза по сравнению с контролем и в 1,2 раза по сравнению с группой препарата сравнения – ондансетрона (рис.2).




А.


Б.


В.

Рис. 2. Влияние соединения РУ-63 и ондансетрона на количество рвотных приступов у собак при введении цисплатина.

Обозначения: по оси X – время от введения цисплатина (мин.*101); по оси Y – количество рвотных приступов; А – цисплатин 3 мг/кг (в/в), Б - цисплатин + соединение РУ-63 (0,1 мг/кг); В - цисплатин + ондансетрон (0,1 мг/кг).


Таким образом, на модели, специфическим образом отображающей процессы возникновения цитотоксической рвоты, исследуемое вещество проявило себя активным антиэметиком, что также подтверждает наличие у него 5-НТ3 антагонистической активности. На модели апоморфиновой рвоты у крыс-самцов вещество РУ-63 оказалось в 5 раз менее активным антиэметиком, чем препарат сравнения метоклопрамид что свидетельствует о слабой выраженности или отсутствии влияния на дофаминовые D2-рецепторы.

Учитывая доказанную роль серотонина в развитии ряда периферических болевых синдромов, были изучены анальгетические свойства вещества РУ-63.

Соединение РУ-63, также как и препараты сравнения – трописетрон и анальгетик смешанного типа – трамадол, значительно повышали порог болевой чувствительности (приблизительно в равной степени) в тесте формалиновой гипералгезии по сравнению с контрольной группой (рис.3).



* - p≤0,05 – достоверно к интактному контролю

# - p≤0,05 – достоверно к формалиновой гипералгезии

Рис. 3. Влияние соединения РУ-63, трамадола и трописетрона на величину болевого порога при механическом давлении в тесте формалиновой гипералгезии.



Исследуемое соединение под лабораторным шифром РУ-63 и препараты сравнения – трописетрон и диклофенак натрия при различных путях введения устраняли проявление адъювантной гипералгезии (рис.4).

Наличие выраженных анальгетических свойств у соединения РУ-63 на моделях периферической гипералгезии может быть обусловлено тем, что как при введении формалина, так и при введении адъюванта Фрейнда, индуцирующего хроническое воспаление, боль носит вторичный характер. Её появление вызвано влиянием ряда медиаторов, в число которых входит и серотонин, на специфические тонкие безмиелиновые волокна типа С. Блокаторы 5-НТ3 рецепторов реализуют свой анальгетический эффект предупреждая возникновение деполяризации С-волокон, опосредованной 5-НТ3 рецепторами (Zeitz K.P. et al., 2002).



* - p ≤ 0,05 –достоверно к интактному контролю

# - p ≤ 0,05 – достоверно к адъювантной гипералгезии

Рис. 4. Влияние соединения РУ-63, диклофенака натрия и трописетрона на величину болевого порога при механическом давлении в тесте адъювантной гипералгезии.


На модели с электрическим раздражением корня хвоста крыс исследуемое соединение, в отличие от препарата сравнения – наркотического анальгетика – промедола, практически не влияло на пороги восприятия электроболевого раздражения в течение всего времени исследования, что можно расценивать как отсутствие центральной антиноцицептивной активности. Полученные данные об отсутствии влияния 5-НТ3 антагонистов на проведение ноцицептивного сигнала в пределах ЦНС, подтверждают литературные данные о профиле антиноцицептивной активности препаратов данного класса (Peng Y. et al., 2001).

Имеются данные, что блокаторы 5-НТ3-рецепторов демонстрируют дозозависимый анксиолитический эффект (Markowitz J. S. et al., 1999; Арушанян Э.В., 2001). При этом следует отметить некоторые особенности действия 5-НТ3 антагонистов как транквилизаторов: эффективность в низких дозах (0,01–0,1 мг/кг), часто встречающаяся обратная зависимость эффекта от дозы препарата, отсутствие побочных эффектов (Barnes J.M. et al, 1992).

На модели «темной/светлой камеры», соединение РУ-63, как и ондансетрон в низких дозах, увеличивают количество выходов из темного отсека в светлый, общее время пребывания в светлом отсеке камеры и латентность выхода из темного отсека камеры (рис.5). У диазепама в изучаемых дозах активность отсутствует.



А.


Б.


Рис. 5. Влияние соединения РУ-63, ондансетрона и диазепама (внутрибрюшинн) на основные показатели поведения животных в тесте «темная/светлая камера» (в % к контролю). Обозначения: А – в дозах 0,01 мг/кг; Б – в дозах 0,1 мг/кг; ЛП – латентный период; КВС – количество выходов в светлый отсек; ОВС – общее время, проведенное в светлом отсеке.
В тесте «приподнятого крестообразного лабиринта» соединение РУ-63 также проявляет себя активным анксиолитиком, в 2–4 раза более сильным, чем ондансетрон по влиянию на основные показатели теста: количеству выходов в открытые рукава лабиринта и время пребывания в них (рис.6).

*- достоверно к контролю (р≤0,05)

° - достоверно к ондансетрону (р≤0,05)

# - достоверно к диазепаму (р≤0,05)



Рис. 6. Влияние соединения РУ-63, ондансетрона и диазепама (при внутрибрюшинном введении) на поведение животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Обозначения: по оси X – дозы исследуемых соединений; по оси Y – величина изменения исследуемых показателей (в % по отношению к контролю); КО - количество выходов в открытые рукава; ВО - время, проведенное в открытых рукавах лабиринта.

В тесте наказуемого взятия воды вещество РУ-63 увеличивает количество подходов к поилке, завершившихся взятием воды. Диазепам не демонстрирует наличия анксиолитической активности ни в одной из исследуемых доз (рис.7).



*- достоверно к контролю (p<0,05)

# - достоверно к диазепаму (p≤0,05)

Рис. 7. Влияние соединения РУ-63, ондансетрона и диазепама (при внутрибрюшинном введении) на число наказуемых взятий воды животными, подвергнутыми неизбегаемому стрессорному воздействию током. Обозначения: по оси X – дозы исследуемых соединений; по оси Y – величина изменения исследуемых показателей (в % по отношению к контролю).


На модели агрессии, вызванной электроболевым раздражением, исследуемое соединение РУ-63 уменьшает количество атак и число вертикальных стоек, в среднем в 2,5 раза, однако, типичный бензодиазепиновый анксиолитик диазепам в исследуемых дозах на данной модели продемонстрировал эффект, превышающий таковой у соединения РУ-63 и ондансетрона (рис.8).

Таким образом, соединение под лабораторным шифром РУ-63 обладает выраженными анксиолитическими свойствами, проявленными на конфликтных и неконфликтных поведенческих тестах, моделирующих страх и тревожность. Спектр психотропной активности вещества РУ-63 сопоставим с таковым у ондансетрона и превышает таковой – у традиционного анксиолитика – диазепама.

*- достоверно к контролю (р≤0,05)

° - достоверно к ондансетрону (р≤0,05)

# - достоверно к диазепаму (р≤0,05)



Рис. 8. Влияние соединения РУ-63, ондансетрона и диазепама (при внутрибрюшинном введении) на поведение крыс в тесте «электроболевого раздражения». Обозначения: по оси X – дозы исследуемых соединений; по оси Y – величина изменения исследуемых показателей (в % по отношению к контролю); ВС- количество вертикальных стоек; АТ – количество атак.




Фармакологические свойства производных бензимидазола с Р2Y1-антагонистической активностью – соединений РУ-286 и РУ-722.

Данные, полученные при in vitro исследовании Р2Y1-антагонистической активности в рядах производных бензимидазола, позволяли рассматривать 8 веществ (РУ-286, РУ-355, РУ-575, РУ-576, РУ-603, РУ-722, РУ-1185 и РУ-1204), превосходящих по активности вещество сравнения Basilen Blue. Однако, при дополнительном исследовании влияния этих веществ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, выяснилось, что только 3 вещества выражено угнетают этот процесс: РУ-286, РУ-722 и РУ-576, величины ЕС20 антиагрегантного действия которых составили 1,510-6М, 9,010-7М и 2,310-5М, соответственно. Величины ЛД50 при внутрибрюшинном введении у мышей составили 282,8 мг/кг, 130,0 мг/кг и 241,7 мг/кг, соответственно.

Таким образом, для дальнейшего изучения были выбраны 2 вещества под лабораторными шифрами РУ-286 и РУ-722 с наибольшим условным терапевтическим индексом (LD50,мг/кг/EC50,C(M)/10-7) 19 и 14, соответственно.

При изучении влияния на агрегацию тромбоцитов в условиях ex vivo было выявлено (рис.9), что наиболее выражено уменьшало показатели АДФ-индуцированной агрегации соединение РУ-722, превышая по эффекту тиклопидин и не уступая клопидогрелю.



Рис. 9. Сравнительная оценка влияния исследуемых соединений и препаратов сравнения на агрегацию тромбоцитов интактных крыс, вызванную различными индукторами. Обозначения: А – степень агрегации; V – скорость агрегации.

Несколько слабее проявлялся антиагрегантный эффект у соединения РУ-286, по способности блокировать АДФ-индуцированную агрегацию занимающего промежуточное место между препаратами сравнения тиклопидином и клопидогрелем.

Исследуемые соединения РУ-286 и РУ-722, а также препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель эффективно подавляли коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, снижая степень агрегации на -86%-98%, а скорость агрегации на 88-99%.

В отношении адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов статистически значимые изменения как степени, так и скорости агрегации были получены только для соединения РУ-286. Сравнительно низкая эффективность изученных веществ и препаратов сравнения в данном тесте согласуется с литературными данными и объясняется другим рецепторным механизмом тромбоцитарного ответа на действие адреналина (Самаль А.Б. и др., 1990; Lenox R.H. et al., 1985).

При исследовании влияния соединений РУ-722 и РУ-286 на показатели коагулограммы статистически значимых изменений получено не было, что свидетельствует об отсутствии прямого антикоагулянтного эффекта в исследуемых дозах через 2 часа после однократного перорального введения.

При исследовании скорости образования тромба in vitro в нативных образцах крови крыс наибольшую эффективность продемонстрировало соединение РУ-722, превышавшее эффекты и тиклопидина и клопидогреля (рис.10).

* - достоверно к контролю (р≤0,05)



Рис. 10. Влияние соединений РУ-286, РУ-722, тиклопидина и клопидогреля (per os, в эквимоляльных дозах) на время наступления полной тромботической окклюзии капилляра в нативном образце крови крыс.

Это согласуется с данными, полученными при изучении агрегации тромбоцитов, а так же литературными данными, указывающими на то, что тромбообразование в нативных образцах крови, зависит, прежде всего, от агрегационной способности тромбоцитов (Yamamoto J. et al., 2003).

Для in vivo изучения антитромботических свойств соединений с антиагрегантной активностью целесообразно использовать модели артериального тромбоза (Angelillo-Scherrer A., 2004) являющиеся тромбоцитзависимыми, так как тромбоциты составляют основную массу образующегося при этом тромба (Пыж М.В. и др., 1990).

В результате обработки каротидной артерии раствором хлорида железа (III) (Kurz K.D. et al., 1990), в очаге поражения развивается реакция Хабера-Вейса, вызывающая в итоге прекращение кровотока (Halliwell B., 1994). Соединения РУ-286 и РУ-722 при предварительном пероральном введении увеличивали время до полной окклюзии сонной артерии (табл.5).

Таблица 5.

ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ РУ-286, РУ-722, ТИКЛОПИДИНА И КЛОПИДОГРЕЛЯ В ЭКВИМОЛЯЛЬНЫХ ДОЗАХ (per os) НА ИНТЕНСИВНОСТЬ КРОВОТОКА В СОННОЙ АРТЕРИИ ИНТАКТНЫХ КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ АРТЕРИАЛЬНОГО ТРОМБОЗА, ИНДУЦИРОВАННОГО ХЛОРИДОМ ЖЕЛЕЗА (III)


Группа

Время достижения 50%-ного уровня кровотока, мин.

Время возникновения полного тромбоза, мин.

Контроль

20

24,6±0,9

РУ-286

-

Более 150*#

РУ-722

90

Более 150*#

Тиклопидин

29

42,7±1,1*

Клопидогрель

-

Более 150*#

* - достоверно к контролю (р≤0,05)

# - достоверно к группе тиклопидина (р≤0,05)


По времени уменьшения кровотока до 50%-ного уровня соединение РУ-722 превосходит тиклопидин в 3 раза. Для соединения РУ-286 и клопидогреля этот показатель за 2,5 часа (продолжительность нембуталового наркоза) зарегистрировать не удалось, что свидетельствует о высокой эффективности соединений РУ-286 и РУ-722, по антитромботической активности превышающих тиклопидин.

Модель артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, в своей основе имеет изменение заряда эндотелия сосудов, что вызывает притяжение отрицательно заряженных лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и фибриногена к участку стенки сосуда, имеющей положительный заряд (Guglielmi G. et al., 1991) с последующей окклюзией сосуда. На данной модели соединения РУ-286 и РУ-722 продемонстрировали выраженные антитромботические свойства превосходя по эффективности тиклопидин в среднем в 2 раза (рис.11).



* - достоверно к контролю (р≤0,05)

# - достоверно к тиклопидину (р≤0,05)

Рис. 11. Влияние соединений РУ-286, РУ-722, тиклопидина и клопидогреля в эквимоляльных дозах (per os) на время полного прекращения кровотока в сонной артерии интактных крыс при моделировании артериального тромбоза, индуцированного электрическим током.


На модели генерализованного тромбоза при внутривенном совместном введении больших доз коллагена и адреналина (DiMinno G. et al., 1983) соединения РУ-286 и РУ-722 увеличивали количество выживших животных (рис.12).



* - достоверно к контролю (р≤0,05)



Рис. 12. Влияние соединений РУ-286, РУ-722, тиклопидина и клопидогреля в эквимоляльных дозах (per os) на выживаемость белых мышей на модели коллаген–адреналинового генерализованного тромбоза.



При этом эффект соединений превышал таковой у тиклопидина в среднем в 2 раза, что свидетельствует о наличии выраженных антитромботических свойств у указанных соединений.

Проявление выраженных антитромботических свойств у соединений РУ 722 и РУ-286 на всех моделях экспериментальных тромбозов различного генеза позволяет предположить, что в основе их механизма действия лежит угнетение агрегации тромбоцитов, так как именно тромбоциты играют ключевую роль в инициации тромбоза. Подобное предположение согласуется с данными, полученными при изучении влияния соединений РУ-286 и РУ-722 на функциональную активность тромбоцитов в условиях in vitro, а также при исследовании действия веществ на сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз в условиях ex vivo.

По ряду показателей в некоторых экспериментальных сериях исследованные производные бензимидазола РУ-286 и РУ-722 уступают клопидогрелю, однако, оригинальный, принципиально другой механизм действия исследуемых соединений и высокая стоимость клопидогреля позволяют считать перспективным дальнейшее изучение данных веществ.

1   2   3


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница