Отчет о научно-исследовательской работе


Аналитическое выделение плазмидных ДНК из трансформированных компетентных клеток



страница7/9
Дата08.06.2016
Размер0.89 Mb.
ТипОтчет
1   2   3   4   5   6   7   8   9

Аналитическое выделение плазмидных ДНК из трансформированных компетентных клеток


Трансформированные лигазными смесями клетки E.coli выращивали из отдельной колонии в 5 мл среды LB (Sigma-Aldrich) с ампициллином (100мг/мл) в пластиковых пробирках объемом 15 мл в течение 15 часов при 370С и интенсивном встряхивании. Затем бактерии осаждали центрифугированием в течение 15 минут на скорости 3,7 тысячи об/мин при 40С. Осадок клеток ресуспендировали в 250 мкл плазмидного раствора I, содержащего 25 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ ЭДТА, 15% сахарозы, и 2 мг/мл лизоцима, с добавлением 10 мгк/мл РНКазы А, переносили в пробирку на 1,5 мл и инкубировали на льду в течение 5 минут. Затем добавляли 250 мкл лизирующего раствора II (0.2 М NaOH, 1% SDS), аккуратно перемешивали и инкубировали 2-3 минуты при комнатной температуре, после чего вносили 350 мкл нейтрализующего раствора III (3 M ацетат калия, pH 5.2), тщательно перемешивали и инкубировали во льду еще 10 минут. После этого лизаты клеток центрифугировали в течение 15 минут на скорости 14 тысяч об/мин при 40С. Супернатант переносили в новую пробирку на 1,5 мл, добавляли 0,7 объема изопропанола, инкубировали в течение 15 минут и центрифугировали еще 15 минут на той же скорости. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл воды, очищенной в системе MilliQ (Millipore).

Получившиеся по данной методике аналитические препараты плазмидных ДНК подвергали рестрикции с целью проверки качества проведенных реакций лигирования и трансформации.

С помощью рестриктазного анализа были отобраны нужные клоны. Для дополнительного контроля качества клонирования, полученные конструкты были отданы на сиквенс в компанию Евроген.

Анализ результатов секвенирования проводился с помощью программы Vector NTI.


ОТ-ПЦР

Для получения кДНК обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы SuperScript II RT (Invitrogen) с использованием олиго(дТ)12-18 праймера на 2 мкг тотальной РНК. Обратная транскриптаза SuperScript II RT имеет пониженную активность РНКазы Н, что позволяет получать полноразмерную кДНК в большем количестве, чем при использовании обратной транскриптазы M-MLV RT. Методика обратной транскрипции описана в инструкции к набору реагентов SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Аликвоты по 2 мкл кДНК вносили в стандартную смесь для ПЦР-амплификации (25 мкл). Для выравнивания температуры плавления GC- и АТ-богатых областей, а также повышения стабильности Taq-полимеразы, в реакционную смесь добавляли глицерин до 5% или формамид до 1 М. Использовали по 12.5 пмоль каждого из праймеров (Таблица ). Температуру отжига праймеров вычисляли с помощью программы OligoAnalyser, имеющейся на интернет-страничке компании IDT DNA (www.idtdna.com/scitools). Для контроля эффективности обратной транскрипции и выравнивания амплифицировали участки мРНК генов «домашнего хозяйства».



Таблица . Последовательности праймеров, использованных для ОТ-ПЦР.

Название

Последовательность

p53 прямой
p53 обратный

5’-GACCTCAAAGCTGTTCCGTCC
5'-CGTCTGGGCTTCTTGCATTC

TRIP6 прямой (экзон7)
TRIP6 обратный (экзон 8)

5’-gtggccaccctggagaaatgt
5’-cgatccagagcaacaattctcac


RIL 4 экзон прямой
RIL 5 экзон обратный

5’-CTCGCTTTCCAGTCCCTCACAAT
5’-TCTAGCATGCCCTGCAAGTAGC

RIL 1 экзон прямой
RIL 7 экзон обратный

5’-gacttcagcgcgcccctcaccatctcacg
5’-gagcttgtcccgtgccttgacgatggtgc


EGFP прямой
EGFP обратный

5’-TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCA
5’-TGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCT

E-cadherin прямой
E-cadherin обратный

5’-CAGCACGTACACAGCCCTAA
5’-GCTGGCTCAAGTCAAAGTCC


Snail прямой
Snail обратный

5’-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA
5’-TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG





Slug прямой
Slug обратный

5’-gcctccaaaaagccaaacta
5’-cacagtgatggggctgtatg


Twist прямой
Twist обратный

5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG
5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG

α-actinin прямой
α-actinin обратный

5’-caacttcaacacgctgcagaccaa
5’-cacgtggtcccatttgccattgat


β-actin прямой
β-actin обратный

5’-gcttgccatccaaccactcagtcttg
5’-gcgtctcctttgagctgtttgcagac


PPIA (Cyclophilin) прямой
PPIA (Cyclophilin) обратный

5’-cttcacacgccataatggc
5’-gtgatcttcttgctggtcttg


GAPDH прямой
GAPDH обратный

5’-CTCGCTCCTGGAAGATGG
5’-CAATGACCCCTTCATTGAC

Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами


Для выделения и анализа мРНК, связанной с полисомами, использовали клетки линии HeLa. Прямой трансфекцией в клетки на 10 см. культуральных чашках вводили необходимые конструкции и инкубировали 1-2 дня, пока культура не дорастет до 70-90% монослоя. Клетки трижды промывали холодным ФСБ с 50 мкг/мл циклогексимида, собирали скребком и освобождали от буфера центрифугированием 3 мин. При 5 тыс. об./мин. в настольной центрифуге. Клеточный осадок лизировали в 2.5 объемах лизис-буфера (10 мМ MgCl2, 80 мМ KCl, 0.2 М Трис-HCl pH 7.4, 5 мМ ЭГTA, 2% Triton X-100 с добавлением ингибиторов РНКаз 1000 ед./мл), лизат наслаивали на подушку из 20% сахарозы, приготовленной на лизис-буфере и центрифугировали в роторе SW50.1 (Beckman) 3 ч. на скорости 43 тыс. об./мин. при 4ºС. РНК из осадка (полирибосомы) и супернатанта (безполисомная фракция) выделяли с помощью реагента Trizol и анализировали методом ОТ-ПЦР, как описано выше.
ГЛАВА 2

Определение эпигенетического состояния гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, анализ метилирования ДНК и гистонов
Установлено, что в ряде злокачественных заболеваний человека определенный процент опухолей демонстрирует эпигенетическую супрессию транскрипции гена PDLIM4/RIL. Наиболее часто супрессия RIL наблюдается в опухолях простаты, толстого кишечника, молочной железы и острой миелоидной лейкемии. При этих заболеваниях метилирование и супрессия гена RIL наблюдается приблизительно в половине случаев. Очевидно, подавление экспрессии гена RIL играет важную роль в канцерогенезе, поскольку восстановление экспрессии сопровождается остановкой пролиферации.

2.1 АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ мРНК RIL В ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА



figs\cpa.gif

Рисунок . Экспрессия мРНК RIL в человеческих опухолях различного происхождения по сравнению с нормальными тканями. Нозерн-анализ образцов тотальной РНК, представленных на микропанели Cancer Profiling Array I (BD Clontech), с помощью RIL-специфического зонда. Все значения были нормализованы с учетом экспрессии мРНК гена «домашнего хозяйства» GAPDH. а – Вид ауторадиограммы микропанели (О – образец тотальной РНК из опухоли; Н – тотальная РНК из окружающей морфологически нормальной ткани от того же пациента). б – Доля пар «норма:опухоль», в которых экспрессия мРНК RIL в опухоли подавлена в 2 и более раз (Н/О > 2), не изменена (0.5 < Н/О < 2) или повышена в 2 и более раз (Н/О < 0.5). Пунктиром выделена область ауторадиограммы блота (а) и столбчатой диаграммы (б), соответствующие парам «норма:опухоль» из молочной железы.

Для определения возможной роли RIL в злокачественной трансформации был проведен анализ уровня экспрессии его мРНК в образцах злокачественных новообразований из разных органов по сравнению с окружающей нормальной тканью методом Нозерн-гибридизации с Cancer Profiling Array I (BD Clontech). На этой микропанели представлена 241 пара образцов «опухоль/норма» из 8 различных тканей человека. Было обнаружено, что уровень экспрессии RIL был подавлен в 2 и более раз в 43% (23 из 53) образцов злокачественных опухолей молочной железы. Тенденция к снижению экспрессии мРНК RIL была также отмечена для опухолей яичника (38%, 6 из 16 пар образцов), почки (35%, 7 из 20 пар) и легкого (29%, 6 из 21).
2.2 ЭКСПРЕССИЯ RIL В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

figs\rilexprmammtum_leg.gif

Рисунок . Экспрессия RIL в линиях клеток карцином молочной железы человека по сравнению с нормальным эпителием молочной железы. а – Экспрессия мРНК RIL по данным ОТ-ПЦР. б – Уровни белка RIL по данным Вестерн-блот анализа с поликлональными козьими RIL-специфичными антителами. в – Морфология клеток использованных культур опухолей молочной железы человека и первичного эпителия. Световая микроскопия. Здесь и далее черной рамкой обозначены культуры клеток с высокой экспрессией RIL, серым пунктиром – линии, где экспрессия RIL недетектируема.

Для независимого подтверждения данных, полученных с помощью блота Cancer Profiling Array I, мы проанализировали уровень экспрессии RIL в панели из 8 клеточных линий карцином молочной железы человека как на уровне мРНК с помощью ОТ-ПЦР, а также методом ПЦР в реальном времени и на уровне белка методом иммуноблоттинга. В качестве контроля были использованы клетки HMEC – культуры первичных эпителиоцитов молочной железы человека (Cambrex) (пассаж 9). Действительно, в четырех случаях из 8 экспрессия RIL оказалась ниже уровня детекции, в то время как в остальных 4 клеточных линиях уровень RIL был сравним с контролем или несколько превышал его (Рисунок а,б).

Бросается в глаза корреляция статуса RIL в этих культурах с морфологией клеток (Рисунок в). Так, высокий уровень экспрессии RIL был выявлен у высоко-агрессивных культур рака молочной железы MDA-MB-231, MDA-MB-435S, MDA-MB-436 и BT-474, клетки которых характеризуются звездчатой или веретенообразной фибробластоидной формой, слабой степенью адгезии и распластанности, высокой скоростью роста и видимым отсутствием межклеточных контактов. Малоагрессивные клеточные линии MCF-7, BT-20, T-47D и MDA-MB-468, наоборот, имеют недетектируемый уровень RIL и сохраняют эпителиальную морфологию и видимые межклеточные контакты.

Таким образом, при исследовании панели линий клеток рака молочной железы было обнаружено, что приблизительно в половине линий экспрессия гена RIL подавлена на уровне транскрипции. При этом было обнаружено, что в другой половине линий уровень экспрессии RIL соответствует контрольным нормальным клеткам молочной железы. Характерно, что два типа линий клеток также отличались по морфологическим признакам. Линии с нормальным уровнем экспрессии гена RIL обладали выраженными признаками морфологической трансформации, утратой эпителиальной морфологии, характерной эпителиально-мезенхимальной трансформации, выраженной дезогранизацией актинового цитоскелета, увеличением подвижности клеток и снижением адгезии. Характерно, что подавление экспрессии RIL в этих линиях с помощью РНК-интерференции не сопровождалось реверсией трансформированного фенотипа, в то время как восстановление экспрессии RIL в клетках, демонстрирующих его супрессию приводило к снижению трансформированного фенотипа.
2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНА RIL ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

Молекулярные повреждения ряда генов имеют большое значение для опухолеобразования. Изучение механизмов канцерогенеза указывает на важную роль инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, обусловленной как генетическими так и эпигенетическими изменениями. Один из механизмов эпигенетическиой регуляции – метилирование промоторных и регуляторных областей, которое приводит к подавлению экспрессии гена. Такие повреждения приводят к нарушению путей регуляции клеточного цикла, стимулируя неконтролируемый клеточный рост и образование опухолей. Аномальное метилирование промоторных районов, вызывающее инактивацию гена RIL, по нашему мнению, может служить маркером рака молочной железы. Поэтому изучение частоты метилирования гена RIL и включении его в специфический профиль метилирования (метилотип) опухолей различного происхождения важно для понимания его роли в канцерогенезе, в том числе в развитии рака молочной железы, что и является нашей задачей.

Для определения частоты метилирования гена RIL в случае рака молочной железы нами были исследованы следующие клеточные линии:

- MCF7, BT-20, T47D, MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-435S, BT-474,

- образцы тканей, полученных от 50 больных раком молочной железы,

- а также образцы неизмененной ткани молочной железы.

Сразу после удаления опухоли образцы тканей замораживали и хранили в жидком азоте. Геномную ДНК выделяли с использованием фенол-хлоровормной реакции.

Метилирование СрG-островков промоторной области определяли с помощью бисульфитной ПЦР, секвенирования и метилчувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. Бисульфитная ПЦР представляет собой процесс амплификации бисульфитно-модифицированной ДНК. Данный метод основан на способности иона гидросульфита, получающегося при растворении бисульфита натрия в воде, взаимодействовать с цитозином, с превращением последнего в урацил, таким образом, при бисульфитной модификации ДНК, все неметилированные цитозины конвертируются в урацил, в то время как метилированные цитозины в составе СрG-островков остаются неизменными. В дальнейшем при амплификации исследуемого участка ДНК все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин.

В результате эпигенетической реактивации было показано увеличение уровня экспрессии RIL/PDLIM4 в клеточных линиях рака молочной железы в среднем в 3,5 раза. Характеристики CpG островка, входящего в состав промотора RIL/PDLIM4: Н/Т = 0,73, состав GC = 73%, длина 801 п.н. В ходе секвенирования промоторного участка метилирование было обнаружено во всех исследуемых клеточных линиях рака молочной железы. Всего было проанализировано 11 СрG-пар, что составило более 20% от числа пар в анализируемом фрагменте. В исследуемых линиях клеток рака молочной железы метилирование промотоной области гена RIL было обнаружено в 79 % случаев, и в 56% случаев в образцах тканей, а метилирование всего CpG островка обнаружено в 18 из 50 образцов РМЖ (36%). Таким образом, ген RIL с полным правом можно отнести к списку генов, демонстрирующих аномальное метилирование при раке молочной железы. Высокий уровень метилирования гена RIL в опухоли, по сравнению с контролем, может быть использован как маркер злокачественной трансформации, а функциональную инактивацию генов-супрессоров можно считать значимым механизмом канцерогенеза.

Идентификация генов с высокой частотой метилирования в опухолях – необходимый шаг в характеристике опухоли. Профиль метилирования в сочетании с другими молекулярно-генетическими маркерами может быть использован для ранней диагностики злокачественного процесса и определения прогноза развития и поведения опухоли. Дальнейшая разработка диагностической тест-системы на основе RIL в качестве маркера позволит осуществлять эффективный скрининг и бороться с заболеванием на разных этапах возникновения и определять тактику терапии.


ГЛАВА 3

Определение активности рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, состояния сигнальных путей на панели линий клеток рака молочной железы
Большинство существующих линий клеток опухолей молочной железы характеризуются отсутствием трех наиболее распространенных маркеров РМЖ – в клетках этих линий не экспрессированы эстрогеновый и прогестероновый рецепторы, и отсутствует амплификация HER2.

В ходе работ по данному проекту была проанализирована панель клеточных линий карцином молочной железы с целью определения функционального статуса рецепторных и нерецепторных тирозиновых киназ, изменение функциональной активности которых наиболее часто наблюдается в опухолях этого типа.

Статус рецептор-ассоциированных тирозиновых киназ был определен в клетках следующих линий:


  1. MCF7

  2. BT-20

  3. T47D

  4. MDA-MB-468

  5. MDA-MB-231

  6. MDA-MB-435S

  7. BT-474

  8. BT-549

  9. MDA-MB-157

  10. SK-BR-3

Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о том, что только в двух клеточных линиях (BT-474 и SK-BR-3) амплифицирован HER2. В то же время, в трех клеточных линиях (BT-20, MDA-MB-468 и MDA-MB-231) наблюдается значительное повышение уровня экспрессии EGFR.

Рис. 13 Статус EGFP/HER2 в панели клеточных линий карцином молочной железы.
Результаты эксперимента хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными, согласно которым, некоторые опухолевые линии, характеризующиеся тройным негативным генотипом, гиперэкспрессируют EGFR.

В ходе следующего эксперимента, в искомой панели клеточных линий была определена активность двух рецептор-неассоциированных тирозин-киназ, Src и Syk. Для обеих киназ показано активное участие в PI3K-сигнальном пути, а также их частая оверэкспрессия в опухолях с тройным негативным генотипом. Результаты эксперимента показали, что две клеточные линии - BT-474 и SK-BR-3 – характеризуются нормальным уровнем активности Src, в то время, как во всех остальных активность Src аномально высока. Киназа Syk, напротив, характеризуется более равномерным распределением активности среди протестированных клеточных линий. Однако уровни ее активности в клетках MDA-MB-231 и MDA-MB-468 были существенно снижены. В ряде работ указывается, что тирозин-киназа Syk ассоциирована с регуляцией актинового цитоскелета клетки, и оказывает существенное влияние на клеточную подвижность. Клетки линий MDA-MB-231 и MDA-MB-468 характеризуются высокоинвазивным характером роста и обладают повышенной подвижностью, что хорошо кореллирует с данными литературы, согласно которым Syk оказывает суппрессирующее действие на рост высокоинвазивных опухолей молочной железы.


Рис. 14 Результаты измерения активности киназ Src и Syk на панели клеточных линий карцином молочной железы


Для выявления возможной связи между уровнями активности тирозиновых киназ и статусом гена RIL данные экспериментов были сведены в общую Таблицу 3:



Клеточная линия

EGFR

HER2

Src

Syk

RIL

MCF7

-

-

+

+

-

BT-20

+

-

+

+

-

T47D

-

-

+

+

-

MDA-MB-468

+

-

+

-

-

MDA-MB-231

+

-

+

-

+

MDA-MB-435S

-

-

+

+

+

BT-474

-

+

-

+

+

BT-549

-

-

+

+

-

MDA-MB-157

-

-

+

+

-

SK-BR-3

-

+

-

+

+


















Полученные данные указывают на существование двух типов линий клеток рака молочной железы, коррелирующих с уровнем экспрессии RIL. Согласно выдвинутой гипотезе, фенотипические различия обусловлены отличиями в механизме активации тирозиновых киназ. Если в линиях, утративших в результате эпигенетическогй супрессии транскрипцию гена RIL активация Src достигается путем отсутствия контроля со стороны фосфатазы PTP-BL, то в линиях, где экспрессия RIL не изменена, трансформация поддерживается за счет иных событий, включающих активацию Src-подобных киназ за счет альтернативных механизмов. Один из таких механизмов может осуществляться путем активации EGFR, другой – путем активации HER2. В этом случае, применение терапии, направленной на подавление HER2 (herceptin) оказаться неэффективным в случае опухолей, реализующих сценарий трансформации за счет подавления экспрессии RIL.
ГЛАВА 4

Проведение секвенирования генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL.

При исследовании экспрессии гена PDLIM4/RIL, детектируемой с помощью ОТ-ПЦР было показано её угнетение в половине из исследованных линий клеток рака молочной железы человека. В другой половине уровень транскриптов гена PDLIM4/RIL находился на уровне, характерном для нормального молочного эпителия, использованного в качестве контроля.

Супрессия транскриптов гена PDLIM4/RIL наблюдалась в линиях MCF7, BT-20, T47D и MDA-MB468. В этих же линиях отмечалось сохранение и даже некоторое увеличение экспрессии Е-кадхерина и утрата экспрессии виментина. Другая группа клеток (MDA-MB231, MDA-MB435S, MDS-MB436 и BT-474), напротив, содержала нормальные уровни транскриптов гена PDLIM4/RIL, но отсутствие экспрессии Е-кадхерина и выраженную экспрессию виментина. Интересно, что виментин также хорошо экспрессируется к контрольных клетках нормального молочного эпителия. При анализе морфологических свойств клеток было также установлено, что летки, характеризующиеся супрессией гена PDLIM4/RIL обладают менее выраженными признаками морфологической трансформации.

Для того чтобы удостовериться в полноценности экспрессии гена PDLIM4/RIL необходимо убедиться в отсутствии мутаций в кодирующей области гена в исследуемых линиях клеток. Для этого на матрице РНК из восьми линий клеток, а также из клеток нормального молочного эпителия с помощью ОТ-ПЦР получали ДНК копии, которые затем подвергали секвенированию на капиллярном секвенаторе. Структура праймеров для амплификациииы была следующей:


RIL-5’-primer^ ctcctcctcagagtccg

RIL 3’ rpimer: gtggaactcgtctgagct


Среди четырех линий клеток без супрессии гена RIL замен нуклеотидов в кДНК, полученной на матрице мРНК не было обнаружено. На Риснке приведена структура полноразмерной мРНК гена PDLIM4/RIL, полученная для всех четырех линий клеток.
1 GCGGCGGCGG CGGCTGCGGC GGCGGCGGCT CCTCCTCAGA GTCCGGCTCA

MetPro HisSerVal ThrLeuArg

51 GGCTCCGGCT GCGGCTCCAG CCCGCGATGC CCCATTCCGT GACCCTGCGC

GlyProSerPro TrpGlyPhe ArgLeuVal GlyGlyArgAsp PheSerAla·

101 GGGCCTTCGC CCTGGGGCTT CCGCCTGGTG GGCGGCCGGG ACTTCAGCGC

·ProLeuThr IleSerArgVal HisAlaGly SerLysAla AlaLeuAlaAla·

151 GCCCCTCACC ATCTCACGGG TCCATGCTGG CAGCAAGGCT GCATTGGCTG

·ALeuCysPro GlyAspLeu IleGlnAlaIle AsnGlyGlu SerThrGlu

201 CCCTGTGCCC AGGAGACCTG ATCCAGGCCA TCAATGGTGA GAGCACAGAG

LeuMetThrHis LeuGluAla GlnAsnArg IleLysGlyCys HisAspHis·

251 CTCATGACAC ACCTGGAGGC ACAGAACCGC ATCAAGGGCT GCCACGATCA ·LeuThrLeu SerValSerArg ProGluGly ArgSerTrp ProSerAlaPro·

301 CCTCACACTG TCTGTGAGCA GGCCTGAGGG TAGGAGCTGG CCCAGTGCCC ·PAspAspSer LysAlaGln AlaHisArgIle HisIleAsp ProGluIle

351 CTGATGACAG CAAGGCTCAG GCACACAGGA TCCACATCGA TCCTGAGATC GlnAspGlySer ProThrThr SerArgArg ProSerGlyThr GlyThrGly·

401 CAGGACGGCA GCCCAACAAC CAGCAGGCGG CCCTCAGGCA CCGGGACTGG ·ProGluAsp GlyArgProSer LeuGlySer ProTyrGly GlnProProArg·

451 GCCAGAAGAT GGCAGACCAA GCCTGGGATC TCCATATGGA CAACCCCCTC ·APheProVal ProHisAsn GlySerSerGlu AlaThrLeu ProAlaGln

501 GCTTTCCAGT CCCTCACAAT GGCAGCAGCG AGGCCACCCT GCCAGCCCAG MetSerThrLeu HisValSer ProProPro SerAlaAspPro AlaArgGly·

551 ATGAGCACCC TGCATGTGTC TCCACCCCCC AGCGCTGACC CAGCCAGAGG ·LeuProArg SerArgAspCys ArgValAsp LeuGlySer GluValTyrArg·

601 CCTCCCGCGG AGCCGGGACT GCAGAGTCGA CCTGGGCTCC GAGGTGTACA ·AMetLeuArg GluProAla GluProValAla AlaGluPro LysGlnSer

651 GGATGCTGCG GGAGCCAGCC GAGCCCGTGG CCGCGGAGCC CAAGCAGTCA GlySerPheArg TyrLeuGln GlyMetLeu GluAlaGlyGlu GlyGlyAsp·

701 GGCTCCTTCC GCTACTTGCA GGGCATGCTA GAGGCCGGCG AGGGCGGGGA ·TrpProGly ProGlyGlyPro ArgAsnLeu LysProThr AlaSerLysLeu·

751 TTGGCCCGGG CCTGGCGGCC CCCGGAACCT CAAGCCCACG GCCAGCAAGC ·LGlyAlaPro LeuSerGly LeuGlnGlyLeu ProGluCys ThrArgCys

801 TGGGCGCTCC GCTGAGCGGC CTGCAGGGGC TGCCCGAGTG CACGCGCTGC GlyHisGlyIle ValGlyThr IleValLys AlaArgAspLys LeuTyrHis·

851 GGCCACGGCA TCGTGGGCAC CATCGTCAAG GCACGGGACA AGCTCTACCA ·ProGluCys PheMetCysSer AspCysGly LeuAsnLeu LysGlnArgGly·

901 TCCCGAGTGC TTCATGTGCA GTGACTGCGG CCTGAACCTC AAGCAGCGTG ·GTyrPhePhe LeuAspGlu ArgLeuTyrCys GluSerHis AlaLysAla

951 GTTACTTCTT TCTGGACGAG CGGCTCTACT GTGAGAGCCA CGCCAAGGCG ArgValLysPro ProGluGly TyrAspVal ValAlaValTyr ProAsnAla·

1001 CGCGTGAAGC CGCCCGAGGG CTACGACGTG GTGGCGGTGT ACCCCAATGC ·LysValGlu LeuVal***

1051 CAAGGTGGAA CTCGTCTGAG CTGGGACCCT GCTCCCACGC CTGCTTCTTA

1101 AGGTCCCTGC TCGGCCGGTG TAAATATGTT TCACCCTGTC CCTCTAATAA

1151 AGCTCCTCTG CTCCACCTTG AACCTGTCAC CTGGCCTGCC ACCCTCCTGC

1201 GCAGGCCATG CATGGCTCCC GAGTACAGTA GTATCTGCTT AGGTGCCAGG

1251 CATGTCCTAG GCTCTGGGTG CAGTAGTGAG CAGGACGGGT ACCATGCTGC

1301 CCTGAAGGGG GCCACAGCCT GGGTGGAAGG CAGACCTGAA TCACAACGGG

1351 CCAGCTCTAG TAATACGAAG GTGAGGTCTG GGATGCTGCG TGCGGCGCGA

1401 CGACAGGAGG TATGACCTGG GTGGGGTCAG GGAAAGTCTT AGCTGAGAAC

1451 TAAGAGATGA GGGAGGCACA AACTCTGCAC GGGGGAACTG TGTGTGCAAA

1501 GGTGAGCTGG GGGCGAGAAA GGCCTCTGTG GCCGTCATCG GCACTAGCGG

1551 GTTGGGGGTG GTGGTGGGGT GCTGGCAGCC TCAGGAGCGA TCGCTCCCCT

1601 GGAGAGGGTG ATTGAGTGTG GAGATCACCG GGGCCGCCGC GGGCCGTCTG

1651 CACTTCTGTT CCAGGTTTTT CTGGCATTTT CTGTTCCAGG TTTCTTCCAC

1701 CCACGAGCAC TTTATTCTCC TCCGAGACCC CCTTTTCTTC CCCTTCCTCT

1751 CTCCCCCACC AGGGGGCGCG CTTAAATTTC CAGACAGAGA CCAGAAGGAA

1801 GGTTTAGAAA GAAAAGAACA CTTGCCCAGG GCAGCTTTGC CCTCCAAGAG

1851 GCTCCCTCCT GTCTCTAAGT CAATTCCACC CCTCCTCGAA GTCCCGGCTT

1901 CCACCCCTCT CCTCAGAGTC CCGGCGTTTA CCTCGTGGTG TGTTTGCCTT

1951 GGGCCTTTCA TGCCCCGGCT GCACACATCG TCTGTGAATT GTGGCTGTTC

2001 ACTCCCGAGG ATGTGTCCTA GACTCCGGGT CGCGTGGATC TACCCTCTAG

2051 TTTACTTGCT CGGGAGAAGA AACTGACTCG TTTTATTTAG TGCCTATTTA

2101 GCGAGCCCAG AGTAACGTAC ATTTGTGCTG TTTTCAATTT TGTGCTATCG

2151 CAAATCACAA AAAAACTGTT ATCAATTCAC ATTCATCATC AGCACGAGAC

2201 CCATTTCCTT GTGCTCCTGC CAGCTCAGGA TATTATGTTT CTTTTTTCAT

2251 TTTTGCCAGT CTGTTAAGTA AAATGTCATA TGCGTTTGTT TTAAAAAAAA

2301 AAAAAA


Рисунок 15. Структура кДНК гена PDLIM4/RIL, полученная при секвенировании четырех линий клеток рака молочной железы с сохраненной экспрессией гtна PDLIM4/RIL.

В оставшихся линиях клеток экспрессия гена PDLIM4/RIL была подавлена. Для определения полноценности кодирующей области гена с помощью ПЦР были амплифицированы экзоны на матрице геномной ДНК, выделенной из этих линий. Были использованы следующие праймеры:


Экзон 1 5’-ctcagagtccggctcag и 5’- ccagactcacccgtgag
Экзон 2 5’-tgctcgcaggtccatgc и 5’-cacctgtgcatacctgc
Экзон 3 5’-ctgccacaggcctgagg и 5’- ctgtacatacctggatc
Экзон 4 5’-cctctctctaataggac и 5’-catctctgtgctacctg

Экзон 5 5’-ctccctcccagcgctgac и 5’-gtggcaggcgtcttacc


Экзон 6 5’-cgggtttcaggggattg и 5’-gtcccagctcagacgag
Секвенирование шести экзонов в четырех линиях не обнаружило замен нуклеотидов. Эти результаты указывают на отсутствие точечных мутаций в кодирующей области гена PDLIM4/RIL в линиях клеток, характеризующихся отсутствием транскриптов.

ГЛАВА 5

Получение данных по эпигенетическому статусу гена PDLIM4/RIL и статусу транскриптома образцов линий клеток рака молочной железы с помощью технологии NGS.

Для определения характерных различий спектров транскрибируемых генов был применен метод секвенирования транскриптома с помощью технологии NGS. Для этого из петидесяти линий клеток рака молочной железы выделяли тотальную РНК методом тризольной экстракции и дочищали ее с помощью Agencourt RNA clean реагента (Beckman-Coulter). На матрице РНК с помощью олиго дТ затравки получали кДНК продукты, представляющие библиотеку для секвенирования. С помощью секвенатора Illumina HiSeq 2500 осуществляли прочитывание библиотек, после чего массив данных по секвенированию экспрессирующихся форм мРНК подвергали биоинформатическому анализу. Этот анализ проводится в настоящее время с целью вычисленения характерных наборов генов, преимущественно экспрессирующихся в линиях клеток, различающихся по экспрессии гена PDLIM4/RIL. В образцах также подсчитывадлсь относительное количество транскриптов, соответствующих гену PDLIM4. При сравнении представленности транскриптов PDLIM4/RIL установлено, в частности, что в линии клеток MCF7 число копий таких транскриптов различается в 250 раз (в меньшую сторону) по сравнению с числом копий в линии клеток MDA-MB435S. В таблице (Приложение) представлено сравнение частот экспрессии генов в линиях клеток MCF7 и MDA-MB435S. В списке присутствуют гены, уровень экспрессии которых различается в большую или меньшую сторону в 2 и более раз. Детальная биоинформатическая обработка проводится в настоящее время и будет представлена в заключительном отчете. Однако уже на данном этапе нами установлено, что имеется массивный кластер генов, экспрессия которых закономерно изменяется в зависимости от супрессии гена RIL. Некоторые из выявленных генов, демонстрирующие максимальные изменения в настоящее время верифицируются с помощью ОТ-ПЦР.


ГЛАВА 6

Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.
При выполнении первого этапа НИР были проведены патентные исследования по теме «Разработка методов выявления эпигенетической инактивации гена супрессора PDLIM4/RIL для применения в диагностике рака молочной железы и выбора оптимальных схем индивидуальной противораковой терапии»

Задачей патентных исследований был анализ уровня техники объекта хозяйственной деятельности, проверка патентной чистоты объекта, выявление тенденций и возможности патентования в РФ.

Согласно заданию на проведение патентных исследований и Регламенту поиска проанализировано около 150 патентных источников информации. Использовались возможности поиска по ключевым терминам: биомаркер, маркер, эпигенетич* супресс*, PDLIM4/RIL, PDLIM, RIL, способ лечения рака молочной железы, опухол*, адапторн* белок(ки), плеч* хромосомы 5 (5q31), reversion-induced LIM-domain, клеточн* линии MCF7, T47D, BT20, BT-483, BT549, MDA-MB231, MDA-MB436, MDA-MB453, MDA-MB468, MDA-MB474, 184B5, AU-565, SK-BR3

Также использовалась возможность поиска по рубрикам МПК 4-12 редакции: C12Q 1/68,

C12N 15/00, A61K38/00, A61K38/16, C07K14/00, G01N 33/48, G01N 33/53; G01N 33/68, A61P 35/00.

В результате проведенного исследования были сформулированы выводы:

1. Объект исследований «новый биомаркер, основанный на эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL для оптимизации способа лечения рака молочной железы» обладает патентной чистотой в отношении Российской Федерации по состоянию:

- на 27.06.2013 – Официальный бюллетень РФ «Изобретения, полезные модели» № 18 за 2013г.

- на 2013.05.30– Бюллетень Евразийского патентного ведомства, № 5, за 2013г.

- на 06.07.2013 – Фонд международных заявок по состоянию на июль 2013г.

2. Результаты исследования объекта НИР на патентную чистоту приведены в таблицах Д.3.1.1, Д.3.1.3 Приложения Д.

3. Данная тема, касающаяся маркера, основанного на эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL для оптимизации способа лечения рака молочной железы является перспективным направлением в области химии медицины.

4. В качестве ближайшего аналога (прототипа) может быть принято техническое решение по заявке RU 2009114745, дата публикации 27.10.2010.

Результаты патентного исследования приведены в Приложении.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На первом этапе выполнения НИР были получены следующие результаты:

1 Определено эпигенетическое состояние гена PDLIM4/RIL на панели линий клеток рака молочной железы путем ПЦР в реальном времени, проведен анализ метилирования ДНК и гистонов.

2 Проведено секвенирование генома линий клеток рака молочной железы с целью выявления мутаций гена PDLIM4/RIL.

3 На основании результатов секвенирования определена взаимосвязь генетических и эпигенетических маркеров (метилирование ДНК гена PDLIM4/RIL, уровень транскриптов гена PDLIM4/RIL) позволяющая дальнейшее изучение их прогностической значимости и оптимизацию методов лечения пациентов, страдающих раком молочной железы.

4 На панели клеток рака молочной железы определена активность рецепторных (EGFR, HER2) и нерецепторных (Src) тирозиновых киназ и определена корреляция с морфологическим фенотипом клеток и уровнем экспрессии PDLIM4.

5 Разработана методика регистрации эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL.

6. Проведены патентные исследования по теме НИР

В рамках данного этапа были выполнены все поставленные задачи, все выводы соответствуют установленным целям, результаты просуммированы, обобщены и готовятся к публикациям, по завершению работ описаны рекомендации возможного практического применения полученных результатов и их актуальность. Все полученные данные оригинальны и приоритенты и лягут в основу НИР второго этапа.


Каталог: downloads -> documents


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница