Отчет о научно-исследовательской работе


Протокол пересева культур клеток



страница5/9
Дата08.06.2016
Размер0.89 Mb.
ТипОтчет
1   2   3   4   5   6   7   8   9

Протокол пересева культур клеток.


1. Приготовить смесь растворов DMEM и сыворотки в отношении 9:1. Рассчитывать объём смеси исходя из способа пересева.

2. Удалить ростовую культуральную среду.

3. Промыть 2 раза по 10 мл раствором PBS.

4. Удалить PBS, остатки PBS убрать пипеткой.

5. К клеткам добавить 0,5 мл раствора трипсина, покачать для равномерного распределения по всей поверхности монослоя. При необходимости поставить клетки в термостат (37°C).

6. Когда монослой клеток разрыхлится под воздействием трипсина, добавить ростовую среду DMEM c 10% FBS (аккуратно, чтобы не возникла пена). Добавляемый объём можно определить из соображений удобства пересева. Например, если пересев идёт на 5 чашек, то можно добавить 9,5 мл.

7. Часть клеток перенести на новые чашки.

8. Добавить ростовую среду до объёма 10мл.



9. Содержимое каждой чашки дополнительно пипетировать для разрушения агрегатов клеток с целью получения гомогенной суспензии. Не бояться образования пены, которая исчезнет при дальнейшем инкубировании в термостате.

Криоконсервация и размораживание клеточных линий.


Для замораживания в жидком азоте (-1960С) клетки снимали с поверхности культуральных сосудов раствором трипсина с версеном (1:3), осаждали из суспензии центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и суспендировали в среде для заморозки, состоящей из среды DMEM с добавлением 40-80%- ФС и 10% ДМСО. Концентрацию клеток доводили до 1-2 млн клеток/мл, расфасовывали клеточную суспензию в полиэтиленовые ампулы фирмы «Nunk» по 1 мл. Ампулы помещали в пары жидкого азота (-1200С) или в холодильник (-700С) на 24 часа, после чего переносили непосредственно в жидкий азот. Размораживали клетки, помещая ампулы в теплую воду с температурой 37 - 410C, после чего отмывали клетки в среде DMEM и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в ростовой среде DMEM(M) с 15% ФБС и высевали в культуральные планшеты или стеклянные сосуды.

Полимеразная цепная реакция.


Реакции проводили со специфическими праймерами в условиях, продиктованных составом праймеров, размером ДНК и в зависимости от типа использованной термостабильной полимеразы. ПЦР проводили с использованием амплификатора фирмы Bio-Rad (США). Для анализа продуктов ПЦР использовали метод гель-электрофореза. Электрофорез проводили в 1,5% горизонтальном агарозном геле в буфере TBE (89 mM Трис-НСl; 2 мМ ЭДТА pH 8.0; 89мМ Н33). Для визуализации ДНК использовали бромистый этидий, который добавляли непосредственно в гель и в буфер в процессе их приготовления до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Оценку длины фрагментов ДНК проводили, сравнивая положения зон проб с зонами маркерной ДНК известной длины.

Синтез комплементарных ДНК


Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием синтетического «случайного» праймера dN6. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 4 мкл пятикратного буфера для обратной транскриптазы (Promega, США), 10 мМ DTT, по 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2,5 М гексамера dN6, 50 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Промега, США) при 370C в течение 1 часа. Перед добавлением обратной транскриптазы смесь прогревали при 650С в течение 2 минут.

Определение нуклеотидных последовательностей кДНК


Секвенирование соответствующих фрагментов генома вирусов и клеток проводили на автоматическом анализаторе ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные последовательности редактировали с помощью программы SeqMan II DNASTAR 7.0. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием сервера Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, США) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), включающего базы данных GenBank (NCBI, США), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) и DDBJ (DNA DataBank of Japan) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали приложение ClustalW программы Mega 4.1.

Все генно-инженерные манипуляции, микробиологические процедуры (получение и трансформация компетентных клеток E.coli, наработка и анализ рекомбинантных ДНК) проводили в соответствии с инструкциями к используемым наборам ферментов и китов.

Для проведения трансфекции плазмидные ДНК были наработаны в препаративных количествах из 1000 мл среды Лурия-Бертани и выделены с использованием набора лабораторных реагентов для выделения плазмидной ДНК, очищенной от эндотоксинов «EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Cat.12362).

Рекомбинантные варианты лентивирусов получали методом трансфекции с использованием Lipofectin Reagent в среде Opti-MEM (Gibco BRL).

Для получения вариантов гена с заданными свойствами проводили синтез перекрывающихся фрагментов гена в виде олигонуклеотидов протяженностью 45-55 пар оснований, их отжиг, последующую достройку брешей полимеразой, соединение фрагментов ДНК лигазой, амплификацию с помощью ПЦР с введением сайтов для рестриктаз. Полученные копии синтетического гена далее вводятся в ДНК-плазмиды с помощью генно-инженерных технологий.

Биоинформатическая обработка данных секвенирования


Филогенетический анализ: Нуклеотидные последовательности для проведения филогенетического анализа были получены из базы данных GenBank. Обработка последовательностей, филогенетический и молекулярно-генетический анализ проводились с использованием программных пакетов MEGA 4 [26] и Vector NTI 9 (InforMax, США).

Генетические расстояния между последовательностями рассчитывали при помощи программы Mega v.4.1 с использованием двухпараметрической модели нуклеотидных замещений Кимуры [27].

Вычисление генетической дивергенции (π) между штаммами вариантов вируса Сендай и другими представителями семейства парамиксовирусов проводили, используя программу DNAsp v. 4.10.9 [28] в соответствии с рекомендациями Нея и Миллера [29] в окне длиной 100 нуклеотидов, с шагом 25 нуклеотидов.

Анализ рекомбинации проводили, используя малый информационный критерий Akaike [30] в программе GARD (Genetic Algorithms for Recombination Detection) [31].

Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были рассчитаны в программе Oligo 6.0.


Каталог: downloads -> documents


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница