Общая характеристика работы актуальность проблемы



Скачать 467.54 Kb.
страница1/4
Дата17.06.2016
Размер467.54 Kb.
  1   2   3   4
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) является важнейшей сельскохозяйственной культурой и одним из наиболее значимых объектов исследований в области генетики, цитогенетики, молекулярной генетики и филогенетики растений. Данный вид имеет аллогексаплоидный геном (2n = 6x = 42, ВВAADD), в образовании которого участвовали диплоидные виды T. urartu (AA), Aegilops speltoides (SS) и Ae. tauschii (DD). Копии одного и того же гена в геномах А, В и D называют гомеологичными генами. Выявление гомеологичных генов и исследование, направленное на понимание того, как согласуется работа гомеологичных генов при формировании признаков мягкой пшеницы, каковы структурно-функциональные отличия между гомеологичными копиями, представляет интерес как с эволюционной, так и с генетико-селекционной точки зрения.

Система генов, участвующих в формировании признаков окраски, может представлять собой удобную модель для сравнительного изучения гомеологичных генов мягкой пшеницы. Во-первых, признаки окраски являются качественными признаками. Различные аллели в локусах, определяющих окраску, дают легко различимые фенотипы (именно с этим связано широкое использование признаков окраски для таксономического определения и для идентификации сортов пшеницы; Якубцинер и Савицкий, 1947). Во-вторых, путь биосинтеза флавоноидных пигментов, обеспечивающих окраску органов, является универсальным для растений, а генетические основы биосинтеза флавоноидов хорошо изучены у диплоидных злаков (кукуруза и ячмень) (Mol et al., 1988; Jende-Strid, 1993; Сhopra et al., 2008). Таким образом, существует основа для выделения генов биосинтеза флавоноидов пшеницы при использовании подходов сравнительной геномики и сравнительной генетики (Laurie and Devos, 2002).

Система генов, участвующих в биосинтезе флавоноидных пигментов у пшеницы, представляет интерес не только как удобная генетическая модель, но и в связи с адаптивным значением некоторых признаков окраски. Например, наличие красной окраски колоса связывают с жизнеспособностью пшеницы в районах с холодным климатом (Darwin, 1883; Синская, 1925; Мартынов и Добротворская, 1997). Красная окраска зерна предупреждает преждевременное прорастание семян (Miyamoto et al., 1961; Freed et al., 1976). Интенсивная антоциановая окраска колеоптиле, стебля и пыльников связана с устойчивостью к твердой и пыльной головне (Богданова с соавт., 2002). Кроме того, антоцианы участвуют в противодействии различным видам абиотического стресса (Chalker-Scott, 1999; Ryan et al., 2002; Gould, 2004).

До настоящей работы были выявлены гены, определяющие фенотип по некоторым признакам окраски мягкой пшеницы (McIntosh et al., 2008), о структурной организации и функциональной роли которых ничего не было известно. Также из генома пшеницы были выделены структурные гены, кодирующие некоторые ферменты биосинтеза флавоноидных пигментов (Li et al., 1999; Himi and Noda, 2004; Himi et al., 2006). Однако в целом взаимосвязь между этими двумя группами генов оставалась невыясненной. Неизвестно было, могут ли гены, определяющие фенотип, непосредственно кодировать ферменты биосинтеза флавоноидных пигментов (как это бывает у диплоидных видов; Dooner et al., 1991) или они являются у пшеницы регуляторными по отношению к структурным генам?

Кроме того, большинство генов, участвующих в формировании окраски у пшеницы, до сих пор не были картированы, а применение у аллополиплоидной пшеницы стандартных методик, разработанных для картирования структурных генов в диплоидных геномах, было затруднено. Для многих структурных генов биосинтеза флавоноидов пшеницы не были выделены нуклеотидные последовательности гомологичных копий. Также, большинство известных генов, определяющих окраску, были до настоящей работы выявлены только в одном или двух из трех диплоидных геномов, входящих в состав генома аллополиплоидной пшеницы (McIntosh et al., 2008). Связано ли это с редкой встречаемостью генотипов, несущих функциональные аллели в отдельных гомеологичных локусах, или с утратой данных копий ввиду структурных изменений генома после аллополиплоидизации, оставалось неизвестным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в установлении геномной локализации и исследовании структурно-функциональных особенностей генов биосинтеза флавоноидных пигментов мягкой пшеницы и ее сородичей. В работе были поставлены следующие задачи:


  • провести генетическое картирование генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски (окраска колеоптиле, пыльников, стебля, листа, колосковых чешуй и перикарпа зерна);

  • изучить распространение данных генов в коллекциях сортов с оценкой динамики частот аллелей у современных сортов по сравнению со стародавними;

  • выяснить функциональную роль генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, в биосинтезе флавоноидных пигментов;

  • выделить последовательности структурных генов, кодирующих отдельные ферменты, участвующие в биосинтезе флавоноидных пигментов, и дать сравнительную характеристику гомеологичных структурных генов мягкой пшеницы и ее сородичей;

  • картировать выделенные структурные гены биосинтеза флавоноидов пшеницы и ржи;

  • охарактеризовать особенности экспрессии гомеологичных генов злаков различного происхождения в геноме аллополиплоидной пшеницы.

Научная новизна работы. В настоящей работе получен ряд новых приоритетных результатов. Данная работа является первым комплексным исследованием молекулярно-генетических механизмов формирования признаков окраски у пшеницы с применением методов классической генетики, молекулярной генетики и геномики. Впервые изучена функциональная роль генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, и показано их участие в регуляции транскрипции структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов. Более двадцати генов пшеницы и ее сородичей картированы впервые, а полученные результаты вошли в международный каталог генных символов пшеницы и международный каталог генов и маркеров ржи.

Впервые проведено сравнительное картирование генов, участвующих в формировании признаков окраски, локализованных в гомеологичных геномах злаков. Установлено, что и регуляторные, и структурные гены биосинтеза флавоноидных пигментов представлены в геноме пшеницы в виде гомеологичных копий. Показано, что гомеологичные копии структурных локусов характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов.

Впервые исследованы взаимоотношения регуляторных и структурных генов, локализованных в разных диплоидных геномах, входящих в состав аллогексаплоидного генома пшеницы. Установлено, что регуляторные гены одинаково активируют гомеологичные копии структурных генов, независимо от того, располагаются регуляторный и структурный ген в одном и том же или разных диплоидных геномах.

Впервые на транскрипционном уровне показано, что при биосинтезе флавоноидных пигментов в органах пшеницы гомеологичные копии структурных и регуляторных генов других видов злаков (эгилопсов, ржи и ячменя) могут компенсировать функции недостающих генов пшеницы.



Практическая ценность работы. Разработаны специфичные маркеры для структурных генов биосинтеза флавоноидов, которые могут использоваться далее для изучения стресс-индуцируемых изменений в транскриптоме пшеницы. Получен ряд новых геном- и хромосом-специфичных маркеров, которые могут эффективно использоваться для идентификации отдельных геномов и хромосом у межродовых гибридов злаков. Предложен эффективный метод генетического картирования структурных генов в аллополиплоидных геномах растений, у которых применение стандартных методик, разработанных для картирования диплоидных геномов, затруднено ввиду наличия гомеологичных копий генов. Данный метод основан на применении геном-специфичных праймеров, выявляющих межсортовой полиморфизм.

Создана база данных по микросателлитным локусам и составлены геномные паспорта для коллекции отечественных яровых сортов мягкой пшеницы, которые могут использоваться в дальнейшем для повышения эффективности регистрации новых сортов, защиты авторских прав и проверки чистоты сортового материала.

Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в НГУ (Новосибирск) и Университете М. Лютера (Галле, Германия), а также на школах для молодых ученых (Новосибирск, Звенигород, Гатерслебен).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Гены, определяющие фенотип пшеницы по признакам окраски, являются регуляторными; разные аллели этих генов предопределяют различия в транскрипционной активности структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов.

2. Регуляторные и структурные гены биосинтеза флавоноидных пигментов представлены в геноме пшеницы в виде гомеологичных копий.

3. Гомеологичные копии структурных генов характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов.

4. При биосинтезе флавоноидных пигментов в органах пшеницы гомеологичные копии структурных и регуляторных генов других видов злаков (эгилопсов, ржи и ячменя) могут компенсировать функции недостающих генов пшеницы.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены более чем на 30 различных российских и международных конференциях, в том числе, на 12-й, 13-й и 14-й международных конференциях Европейского сообщества по анеуплоидам пшеницы (EWAC) (2002, Норвич; 2005, Прага; 2007, Стамбул), 6-й и 8-й Гатерслебенской международной научной конференции (2002 и 2005, Гатерслебен), 11-м международном симпозиуме по молекулярным маркерам (2003, Гатерслебен),
2-й всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы генетики» (2003, Москва), 3-м и 5-м съездах ВОГиС (2004 и 2009, Москва), 7-м съезде Общества растениеводства (GPZ; 2004, Галле; приглашенный доклад), 2-м рабочем совещании консорциума по тандемным повторам «Биоинформатика, Геномика и Функциональность микросателлитов и VNTR» (2006, Будапешт), 1-х и 2-х чтениях памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (2007 и 2009, Москва, Дубна), международной конференции «Молекулярное картирование и селекция растений с помощью маркеров» (2008, Вена), 20-м Генетическом конгрессе (2008, Берлин), 11-м международном симпозиуме по генетике пшеницы (2008, Брисбен), научной конференции «Эколого-генетические проблемы селекции растений» (2008, Краснодар), международной конференции «Хромосома 2009» (2009, Новосибирск),
8-й международной конференции по пшенице (2010, Санкт-Петербург), международной конференции «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), 7-й международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома» (2010, Новосибирск), 3-й международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции», посвященной Н.В. Тимофееву-Ресовскому (2010, Алушта).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 27 статей в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 2 главы в зарубежных научных монографиях и 20 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 325 страницах печатного текста, включая 43 таблицы и 80 рисунков. Список цитированной литературы содержит 561 работу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Определение хромосомной локализации генов, ДНК-маркеров и физическое картирование осуществляли с помощью нуллитетрасомных, дителосомных и делеционных линий сорта Chinese Spring (CS) мягкой пшеницы (Sears, 1944, 1946; Driscoll and Sears, 1971). Для генетического картирования и теста на аллелизм использовали популяции (табл. 1). Для изучения распространения аллелей, контролирующих окраску различных органов у пшеницы, и микросателлитных аллелей использовали коллекции сортов мягкой пшеницы: по 36 образцов из Албании (1941 и 1994 гг.), Индии (1937 и 1976 гг.) и Непала (1937 и 1971 гг.) и 54 яровых отечественных сорта (1926-2001 гг.) (Khlestkina et al., 2004), поддерживаемые в Генбанке IPK (Гатерслебен), ИЦиГ СО РАН (Новосибирск) и ВИР им. Вавилова (Санкт-Петербург). Анализ транскрипции структурных генов биосинтеза флавоноидов проводился при использовании различных генетических моделей, описанных в таблице 2. Фенотипическая оценка признаков окраски (рис. 1) в популяциях 1-3, 5, 7, 10-13 проводилась автором диссертации лично, в популяциях 4, 8-9 и российской коллекции пшеницы - совместно с к.б.н. Пшеничниковой Т.А. (ИЦиГ СО РАН). Данные по окраске колоса популяции 6 и образцов пшеницы из Албании, Индии и Непала предоставил Dr. Börner A. (IPK, Гатерслебен). Соответствие наблюдаемого в популяциях расщепления по маркерам и признакам теоретически ожидаемому определяли с помощью критерия χ2 (Гершензон, 1979).



ДНК растений выделяли согласно методике Plaschke et al. (1995). Выделение и очистку РНК растений проводили при использовании наборов реагентов «Plant Rneasy Kit», «RNase-free DNase set» и «RNeasy MinElute Cleanup Kit» (Qiagen). кДНК синтезировали из 1 мг суммарной РНК с помощью обратной транскрипции, используя олигонуклеотидную затравку (dT)15 и набор реагентов «Omniscript Reverse Transcription kit» (Qiagen).

Таблица 1. Популяции, используемые для картирования и тестов на аллелизм, обозначения генов, изученных с их помощью в настоящей работе.



Родительские линии популяции

Популяция (численность)

Гены

1

T. aestivum Жница / T. aestivum TRI 542

F2 (48), Khlestkina et al., 2006

Rg-A1b

2

T. aestivum i:S29BgHg / T. aestivum TRI 546

F2 (97), Khlestkina et al., 2006

Rg-A1c

3

T. aestivum Federation / T. aestivum TRI 546

F(105), Khlestkina et al., 2006

Rg-B1b

4

T. aestivum Голубка /
T. aestivum Новосибирская 67

F2 (74), Khlestkina et al., 2006

Rg-D1c, Rc-D1, Pc-D1, Pan-D1, Plb-D1

5

T. aestivum Голубка / T. aestivum L301

F2 (44), Khlestkina et al., 2006

Rg-D1c

6

T. durum х Ae. tauschii W7984 /
T. aestivum Opata 85

RIL* (111), van Deynze et al., 1995

Rg-D1b

7

T. durum х Ae. tauschii SN-N /
T. aestivum Ульяновка

F2 (146), Khlestkina et al., 2009

Rg-A1c, Rg-D1b

8

T. aestivum Жница / T. aestivum i:S29BgHg

F2 (154), Khlestkina et al., 2009

Rg-A1b, Rg-A1c

9

T. aestivum Голубка / T. durum х Ae. tauschii W7984

F2 (93), Khlestkina et al., 2009

Rg-D1b, Rg-D1c

10

T. aestivum СS(Hope 7B) /
T. aestivum TRI 2732

F2 (134), Khlestkina et al., 2002

Rc-B1, Pc-B1, Pls-B1, Plb-B1

11

T. aestivum TRI 19286 / T. aestivum CS

F2 (108)

Pc-D1, Pls-D1, Plb-D1

12

T. durum TRI 15744 / T. durum TRI 2719

F2 (108), Khlestkina et al., 2010

Pg, Pp1, Pp3, Rc-B1, Pc-B1, Pls-B1, Plb-B1

13

T. aestivum Саратовская 29 /
T. aestivum С29(YP 4D*7A)

DH** (108), Khlestkina et al., 2010

Rc-A1, Pc-A1, Pls-A1, Plb-A1

14

T.timopheevii k-38555 / T. militinae

F2 (70), Salina et al., 2006

F3h-A1

15

T. aestivum Саратовская 29 / T.spelta

F2 (42), Khlestkina et al., 2011

F3h-B1

16

T. aestivum СS(Hope 7A) / T. aestivum TRI 15010

F2 (74), Khlestkina et al., 2002

F3h-B2

17

T. aestivum Мироновская 808 / T. aestivum Ai-bian

F2 (71), Börner et al., 1997

F3h-D1

18

T. aestivum Скала /
T. aestivum Саратовская 29-T. timopheevii 842

F2 (93), Leonova et al., 2002

F3h-G1

19

S. cereale Вятка / S. cereale Monstrous

F2 (72), Malyshev et al., 2003

F3h-R1, Ans

20

S. cereale Р105 / S. cereale Р87

F2 (72), Malyshev et al., 2003

3Rt

21

S. cereale Вятка / S. cereale Steel

F2 (72), Malyshev et al., 2003

-***

22

S. cereale Steel / S. cereale Monstrous

F2 (72), Malyshev et al., 2003

-***

* DH – double haploid, ** RIL – recombinant inbred lines, *** популяции использовались для построения микросателлитных карт и сравнительного картирования.
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, используя «Touchdown» протокол (Somers et al., 2003). Количественная ОТ-ПЦР проводилась в трех повторностях на кДНК при использовании набора реагентов «QuantiTect SYBR Green Kit» (Qiagen) и системы «Applied Biosystems 7000 (или 7900) HT» согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР в реальном времени осуществлялся с помощью программы SDS 1.3. (или 2.2.) при использовании порогового метода сравнения графиков накопления ДНК (Ct) и с определением эффективности ПЦР по последовательным разбавлениям образца. Для стандартизации количества кДНК матрицы осуществлялась количественная ОТ-ПЦР с праймерами к референсным генам Ubc и Gapdh пшеницы. Оценка достоверности различий, выявляемых при анализе транскрипции гомеологичных копий генов, осуществлялась с помощью t-критерия Стьюдента (Васильева, 2000).

Таблица 2. Генетические модели, используемые для анализа транскрипции генов, участвующих в формировании окраски

Ген


Растительный материал

Ткань (гены, определяющие фенотип)

F3h-1 и Chi

почти изогенная линия мягкой пшеницы i:S29BgHg (Arbuzova et al., 1998), интрогрессивная (почти изогенная) линия CS-Ae.tauschii 1D-4 (Pestsova et al., 2006)

колосковые чешуи (Rg-A1c, -Rg-D1b)

Chi, F3h-1, Ans и 3Rt

пшенично-ржаные дополненные линии CS/Imperial (Driscoll and Sears, 1971)

колеоптиле
(Rc-R1b)

F3h-1

рекомбинантные линии мягкой пшеницы Саратовская 29/Саратовская 29(Yanetzkis Probat 4D*7A) (Khlestkina et al., 2010)

колеоптиле
(Rc-A1b)

F3h-1

рекомбинантные линии мягкой пшеницы CS(Hope 7B)/TRI 2732 (Khlestkina et al., 2002)

колеоптиле
(Rc-B1b)

F3h-1, Сhi-B1

интрогрессивные линии CS-Ae.tauschii 7D
(Pestsova et al., 2006)

колеоптиле
(Rc-D1b)

F3h-A1, -B1, -D1

сорт мягкой пшеницы Саратовская 29

колеоптиле
(Rc-A1, Rc-D1)

F3h-A1, -B1, -D1, -B2 и Сhi-B1

линия мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы CS(Hope 7А) (Kuspira and Unrau, 1958)

колеоптиле
(Rc-A1b)

F3h-A1, -B1, -D1, -B2 и Сhi-B1

линия мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы CS(Hope 7B) (Kuspira and Unrau, 1958)

колеоптиле
(Rc-B1b)

F3h-A1, -B1, -D1, -B2

сорт мягкой пшеницы Мироновская 808

колеоптиле
(Rc-D1b)

F3h-A1, -B1, -R1

линия L2R(2D)с замещением хромосомы 2D сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 на хромосому 2R сорта ржи Онохойская (Силкова с соавт., 2006)

колеоптиле
(Rc-1b)

F3h-1

пшенично-эгилопсные дополненные линии CS/Ae.speltoides 7S, CS/Ae.longissima 7S, CS/Ae.searsii 7S (Friebe et al., 1993, 1995, 2000)

колеоптиле
(Rc-S1b)

F3h-1



линия с замещением хромосомы 7D сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28 на хромосому 7Нm ячменя H. marinum (Трубачеева с соавт., 2008)

колеоптиле
(Rc-H1b)

Myc-A1

почти изогенная линия мягкой пшеницы i:S29Pp1Pp2 (Arbuzova et al., 1998)

перикарп зерна (Pp3)

Электрофоретический анализ геномной ДНК, плазмидной ДНК и ПЦР-продуктов проводили согласно Maniatis et al. (1982). ПЦР-фрагменты выделяли из 1% агарозного геля с помощью набора реагентов «MinElute gel extraction kit» и клонировали при использовании «PCR Cloning plus Kit» (Qiagen). ДНК плазмид выделяли методом щелочного лизиса (Maniatis et al., 1982). Клонированные фрагменты ДНК анализировали с помощью набора для секвенирования «ABI PRISM Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit» (Perkin Elmer) при содействии ЦКП СО РАН «Межинститутский центр секвенирования». Кластерный анализ выполнялся с помощью программы MEGA 3.1. (Kumar et al., 2004) при использовании алгоритма UPGMA.

Для разработки праймеров к генам биосинтеза флавоноидов пшеницы и ржи и для кластерного анализа использовались последовательности одноименных генов других видов растений, а также EST пшеницы и ржи, выявленные в банках данных нуклеотидных последовательностей NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/) и GRAINGENE (http://wheat.pw.usda.gov/) с помощью алгоритмов UniGene (Pontius et al., 2003) и BLAST (Altchul et al., 1990). Множественное выравнивание последовательностей проводилось с помощью программы MULTALIN (Corpet, 1988), а конструирование праймеров - с помощью компьютерной программы OLIGO (Rychlik and Rhoads, 1989). Для молекулярного картирования, а также для анализа коллекций пшеницы использовались микросателлитные маркеры GWM (Röder et al., 1998; Ganal and Röder, 2007), GDM (Pestsova et al., 2000), BARC (Song et al., 2002), WMC (Somers et al., 2004) и TAGLGAP (MW1B002; Devos et al., 1995). Микросателлитный анализ проводился согласно протоколу, описанному Röder et al. (1998). Построение молекулярно-генетических карт проводилось с помощью компьютерной программы MAPMAKER 2.0 (Lander et al., 1987).





Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница