Методические указания к практическим занятиям Красноярск сфу 2013 ббк 30. 16




Скачать 482.96 Kb.
страница3/4
Дата13.08.2016
Размер482.96 Kb.
1   2   3   4

2 ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Кинетические кривые роста микроорганизмов характеризуются несколькими фазами в развитии культуры (рисунок 2.1). После введения инокулята обычно наблюдается индукционный период в развитии культуры (лаг-фаза), в течение которого не происходит заметного роста концентрации клеток. В этот период клетки адаптируются к питательной среде, перестраивается метаболизм, синтезируются необходимые ферменты.



I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста;

IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания
Рисунок 2.1 – Кинетическая кривая роста популяции микроорганизмов
Лаг-фаза сменяется фазой экспоненциального роста, в течение которой быстро накапливается биомасса. Затем в связи с истощением субстрата фаза экспоненциального роста на некоторое время сменяется фазой линейного роста. В дальнейшем скорость роста еще больше замедляется (фаза замедления роста) лизисом клеток. В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно продолжительную стационарную фазу, при которой рост компенсируется отмиранием и лизисом клеток. При полном истощении субстрата наступает фаза отмирания клеток.

Многочисленные экспериментальные исследования позволили установить следующие важные закономерности:

- скорость изменения числа микроорганизмов в экспоненциальной фазе роста пропорциональна концентрации клеток в системе

dX/dt = X, (2.1)


где X – концентрация клеток;

 – коэффициент пропорциональности (удельная скорость роста), имеет размерность обратного времени, обычно ч-1.

Интегрирование этого уравнения при начальных условиях Х = Хо и t = 0 даёт зависимость концентрации клеток от времени роста
Х = Хо · ехр(t). (2.2)

В большинстве случаев значение удельной скорости роста зависит от концентрации лимитирующего субстрата S в соответствии с уравнением Моно


(S) = m · S/(Ks + S), (2.3)
где m – максимальная удельная скорость роста, ч-1;

Ks – константа сродства субстрата к микроорганизмам (субстрат ная константа).

По форме это уравнение соответствует уравнению Михаэлиса-Ментен.
2.1 Количественные характеристики роста культур микроорганизмов
Удельная скорость роста. Уравнение (2.2), представленное в логарифмической форме, может быть использовано для определения удельной скорости роста:

lnX = lnXo + t. (2.4)


В координатах lnX от t экспоненциальная фаза роста представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен величине . Удельная скорость роста может быть также вычислена по формуле
lnX2/X1 = (t2 – t1), (2.5)
где X1 и X2 – соответственно концентрации биомассы в моменты времени t1 и t2;

 – коэффициент пропорциональности, ч-1.

По аналогии с уравнением Михаэлиса-Ментен константы уравнения Моно могут быть определены на основе линеаризации уравнения (2.3):

1/ = 1/m + (Ks/m)1/S; (2.6)


 = m – Ks (/S); (2.7)
/S = (m /Ks) – /Ks; (2.8)
S/ = (Ks/m) + S/m. (2.9)
Кроме удельной скорости роста, культура может характеризоваться также временем удвоения биомассы или временем генерации
g = удв. = ln2/. (2.10)
Экономический коэффициент или выход биомассы. Экономический коэффициент определяется соотношением
Y = X/S, (2.11)

где X – увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата S.

В периодических культурах, как правило, определяется средняя величина за весь период роста
Yср = (Х – Хo)/(So – S), (2.12)
где Хo и Х – начальная и конечная концентрации биомассы;

So и S – начальная и конечная концентрации субстрата.

Конкретный штамм характеризуется величиной Y за весь период экспоненциального роста. Экономический коэффициент может определяться для потребления любого субстрата, других компонентов питания, а также в отношении кислорода.



    1. Ингибирование и активация роста микроорганизмов


Полное конкурентное ингибирование. В этом случае удельная скорость роста в экспоненциальной фазе определяется выражением
 = (m S)Ks(1+ i/Ki) + S, (2.13)

где i – концентрация ингибитора;

Ki – константа ингибирования.

Зависимость в обратных координатах (метод Лайнуивера и Бэрка) имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат в точке, равной 1/m. На оси абсцисс прямые отсекают отрезки, равные -1/Ks (рисунок 2.2).

Константу конкурентного ингибирования Ki можно определить с помощью выражения

Кэф = Ks(1 + i/Ki), (2.14)


где Кэф – эффективное значение субстратной константы с учётом ингибирования, если представить экспериментальные данные в координатах Кэф от i.
-1/Ks -1/
а б

Рисунок 2.2 – Зависимость  от S в обычных (а) и двойных обратных координатах (б) при конкурентном ингибировании


Для определения Ki можно применить также метод Диксона, для чего экспериментальные результаты откладывают в координатах 1/ от i.

Полное неконкурентное ингибирование. В этом случае удельная скорость роста культуры в фазе экспоненциального роста определяется выражением
μ = (m S)/(1 + i/Ki) (Ks + S). (2.15)
Зависимость в координатах уравнения Лайнуивера и Бэрка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс (рисунок 2.3).

а) б)


Рисунок 2.3 – Зависимость  от S в обычных (а) и двойных обратных координатах (б) при неконкурентном ингибировании
Константу неконкурентного ингибирования можно определить с помощью выражения

m.каж = m/(1 + i/Ki) (2.16)


посредством построения графика 1/m.каж от i.

Неконкурентная активация. Удельная скорость роста культуры в этом случае определяется формулой

 = mS(Kr + r)/(Kr + r)/(Ks + S), (2.17)


где Kr – константа активации;

 – коэффициент (больше 1);

r – концентрация активатора.

Зависимость скорости роста в координатах уравнения Лайнуивера и Бэрка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс. Анализ уравнения (2.17) можно проводить с помощью выражения


m каж = m(Kr + r)/(Kr + r), (2.18)
преобразованного к виду
1/m каж/(m – 1) = 1/( – 1) + Kr/( – 1)r. (2.19)
Построение графика в координатах этого уравнения 1/m каж/(m – 1) от 1/r позволяет провести раздельное определение констант  и Kr.
2.3 Интегральная форма уравнения роста микробных популяций
Замедление скорости роста культуры микроорганизмов (уравнение Ферхюльста). Предполагается, что уравнение роста имеет вид:
dX/dt = X – X/Xm, (2.20)
где Xm – предельное накопление биомассы.

Интегрирование этого уравнения при начальных условиях t = 0 и Х = Хо даёт уравнение

Х(t) = b · exp(t)/1+aexp(t), (2.21)
где a = 1/(Xm/Xo) -1, b = (Xm/Xo)/(Xm/Xo) -1.

Время , при котором концентрация биомассы достигает половины предельного значения, можно вычислить по уравнению (2.21) при Х = Xm/2Xo


 = Ln (Xm/Xo). (2.22)
При условии Xm  Xo, получим
ln(Xm/Xo)Х/(Xm/Xo – Х) = t. (2.23)
Если неизвестна начальная концентрация, а известна кинетика Х во времени, то можно воспользоваться уравнением
lnX/(Xm – X) = t + С, (2.24)
где С = lnXo/Xm.

Тангенс угла наклона зависимости логарифмической функции этих уравнений даёт возможность определить удельную скорость роста .



Интегральная форма уравнения роста. Если в уравнении роста культуры учесть расход лимитирующего субстрата, то, используя уравнения (2.1), (2.3) и (2.12), подставив выражение для  в уравнение Моно (2.3) его значение из уравнения (2.12), получим дифференциальное уравнение роста

dX/dt = mX/1 + Ks/So – (X – Xo)/Y. (2.25)


Интегрирование этого уравнения даёт уравнение роста Моно в интегральной форме:
1 + YKs/(YSo + X)lnX/Xo – YKs/(YSo + X)ln(YSo + Xo – X)/YSo = mt. (2.26)
Это уравнение можно записать в виде:
(1+В)lnX/Xo – Bln(YSo + Xo – X)/YSo = mt. (2.27)
При переходе к безразмерной переменной N = X/Xo получим
(1+В)lnN – Bln(1 + A – AN) = mt, (2.28)
где А = Xo/YSo или
lnN – B/(1 + В) · ln(1 + A – AN) = mt/(1 + В). (2.29)
Культивирование микроорганизмов обычно проводят в условиях, когда предельное накопление биомассы существенно превышает Хо: YSoХо; при этом получим А  1 и тогда уравнение (2.29) приобретает вид:

lnN – Ks/(Ks + So) ∙ ln(1 – AN) = mtSo/(Ks + So). (2.30)


В условиях малого накопления биомассы и небольшого расхода субстрата АN  1, N  1/A = YSo/Xo и тогда второй логарифмический член уравнения близок к нулю, следовательно,
lnN = mtSo/(Ks + So), или Х = Хо · ехр{mSo/(Ks + So)t}, (2.31)
т. е. имеет место экспоненциальный рост культуры.

В режиме, близком к истощению субстрата, AN1 и при этом условии


Ks/(Ks + So)ln(1 – AN)  lnN и тогда (2.32)
Ks/(Ks + So)ln(1 – AN)  mtSo/(Ks + So) или (2.33)
(1 – AN)  ехр(mSo/Ks)t. (2.34)
При достаточно больших временах культивирования
N = 1/A = YSo/Xo, или (2.35)
Xm = Yso. (2.36)
Это выражение для предельного накопления биомассы в периодической культуре. С учётом внесенного инокулята Хо получим
Xm = YSo + Хо. (2.37)
Рост в условиях нулевого порядка по субстрату. Если Ks  So, то уравнение (2.30) будет иметь вид:
lnN – ln(1 – AN) = (mSo/Ks)t или (2.38)
N/(1 – AN) = ехр(mSo/Ks)t. (2.39)

При Ks  So


Х/Хо = ехр(mSo/Ks)t/1 + (Хо/YSo) ∙ ехр(mSo/Ks)t, (2.40)
т. е. получим уравнение Ферхюльста. Если найдено время , в течение которого концентрация биомассы достигает половины от предельного накопления, то при известном значении YSo/Xo можно определить группу параметров:

mSo/Ks = (lnYSo/Ks)/. (2.41)


Линеаризация кривой роста во всём интервале времени в координатах уравнения

ln(X/Xm – X) = (mSo/Ks)t + C (2.42)


позволяет по тангенсу угла наклона прямой определить параметр mSo/Ks.

Интегральное уравнение роста микробной популяции в условиях истощения субстрата можно представить в форме


lnN – Фln(1 – AN) = t, (2.43)
где Ф = Ks/(Ks + So), (2.44)
 = mSo/(Ks + So). (2.45)

Это же уравнение можно записать в виде


N/(1 – AN) = exp(t). (2.46)
При этом Ф = 1, если Ks  So, Ф  1, если Ks  So.

Из экспериментальных данных можно определить параметр А = Xo/YSo; параметры Ф и  можно определить с помощью одной из линеаризованных форм уравнения (2.43):

(1/t)lnN =  + (1/t)Фln(1 – AN), (2.47)
lnN/ln(1 – AN) = Ф + t/ln(1 – AN). (2.48)
При известном значении So и определённых из экспериментальных данных величин Ф и  можно вычислить значение Ks (при Ф  1) и m:
Ks = ФSo/(1 – Ф), (2.49)
m = /(1 – Ф). (2.50)
2.4 Ингибирование роста высокими концентрациями субстрата
Уравнение для удельной скорости роста при ингибировании роста субстратом имеет вид:
 = mSo/Ksэфф. + So(1 + So/Kiэфф.), (2.51)
где Kiэфф – константа ингибирования субстратом.

При малых концентрациях субстрата, когда So  Kiэфф, уравнение (2.51) преобразуется в обычное уравнение Моно

 = mSo/(Ksэфф. + So), (2.52)
из которого стандартными способами могут быть определены его параметры.

При высоких концентрациях So  Ksэфф. скорость роста описывается уравнением

 = m/(1 + So/Kiэфф.). (2.53)
Это уравнение может быть представлено в виде:

1/ = 1/m + 1/m Kiэфф, (2.54)


из которого графически могут быть определены параметры m и Kiэфф.
2.5 Задачи к разделу 2 «Периодическое культивирование микроорганизмов»
Задача 1. При исследовании роста культуры микроорганизмов в периодических условиях получены следующие экспериментальные данные:

t, ч

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

D, е.о.п.

0,113

0,142

0,190

0,262

0,330

0,449

0,580

Определить удельную скорость роста.
Задача 2. Определить m и Кs для роста на среде с глюкозой культуры микроорганизмов, исходя из следующих экспериментальных данных:

S, мМ/л

1

3

5

7

10

12

14

16

, ч-1

0,23

0,38

0,43

0,47

0,49

0,50

0,50

0,50


Задача 3. Определить m и Кs для роста дрожжей Candida utilis на на среде с этанолом и уксусной кислотой на основе следующих экспериментальных данных:

Концентрация

этанола,

мМ/л


Максимальная уд.

скорость роста ,

ч-1


Концентрация

уксусной кислоты,

мМ/л


Максимальная уд. скорость роста ,

ч-1



1

0,200

1

0,140

3

0,300

2

0,217

5

0,333

4

0,283

7

0,370

7

0,300

9

0,383

10

0,310

11

0,400

14

0,310


Задача 4. Определить константу неконкурентного ингибирования этанолом роста бактерий в условиях, когда So  Ks на основе экспериментальных данных:

Концентрация этанола, мМ/л

0

15

31

46

126

, ч-1

0,55

0,46

0,38

0,27

0,14


Задача 5. Определить тип ингибирования роста, m, Кs, Кi,  на основе следующих экспериментальных данных:

S, мМ/л


i, мМ/л

0

10

20

30

, ч-1

1

0,091

0,058

0,047

0,041

2

0,167

0,109

0,088

0,078

3

0,231

0,153

0,125

0,111

5

0,333

0,227

0,188

0,167

10

0,500

0,385

0,300

0,269

15

0,600

0,441

0,469

0,427


Задача 6. Определить несколькими способами константы уравнения Моно для роста дрожжей на этаноле на основе следующих экспериментальных данных:

t, ч

Х, г/л

S, мМ/л

t, ч

Х, г/л

S, мМ/л

0

0,058

16,3

4,5

0,253

8.5

0,5

0,058

16,0

5,0

0,299

7.2

1,0

0,078

15,5

5,5

0,331

5.0

1,5

0,100

15,0

6,0

0,403

2.6

2,0

0,127

14,2

6,5

0,473

0,3

2,5

0,143

13,4

7,5

0,513




3,0

0,169

12,5

8,0

0,513




3,5

0,192

11,4










4,0

0,214

10,1












Задача 7. Определить экономический коэффициент для роста дрожжей на среде с этанолом и уксусной кислотой по экспериментальным данным:

Этанол

Уксусная кислота


Х – Хо, г а.с.м.

So – S, мМ/л

Х – Хо, г а.с.м.

So – S, мМ/л

0,02

0,8

0,02

1,5

0,05

1,8

0,03

2,9

0,08

2,7

0,04

3,6

0,10

3,1

0,08

4,6

0,15

3,7

0,09

5,4

0,18

4,9

0,11

7,3

0,21

6,0

0,13

8,7

0,25

6,9

0,18

11,6

0,29

8,5

0,25

13,5

0,30

10,0

0,26

15,8

0,34

10,8

0,33

17,7

0,37

11,6







0,40

13,4








Задача 8. Скорость роста культуры микроорганизмов подчиняется уравнению Ферхюльста. Определить , если Хm/Xo = 100, а время, при котором концентрация биомассы достигает половины максимальной, составляет 30 ч.
Задача 9. Определить предельное накопление биомассы, если Xo = 0,01 г/л; Ys = 0,1; So = 10 г/л.
Задача 10. Определить m, Ks, Ys для роста дрожжей на среде с глюкозой:

t, ч

0

2

4

6

8

10

12

14

16

20

Х, г/л

0,25

0,26

0,28

0,30

0,39

0,79

1,32

2,5

5,85

10,5

S, г/л

20,0

20,0

19,9

19,6

19,2

18,9

18,4

16,6

9,2

1,3


Задача 11. Определить m, Ks эфф., Ki эфф. для роста дрожжей на среде с уксусной кислотой для случая ингибирования роста избытком субстрата.

Этанол


Уксусная кислота

S, мМ/л

, ч-1

S, мМ/л

, ч-1

1

2

3

4

1

0,20

1

0,14

3

0,30

3

0,22

5

0,33

5

0,28

7

0,37

8

0,30

9

0,39

11

0,31

11

0,40

15

0,30

14

0,40

20

0,29

22

0,38

26

0,29

30

0,39

60

0,28

100

0,34

100

0,25

187

0,33

200

0,21

260

0,30

400

0,10

353

0,28







610

0,18







780

0,14









Задача 12. При исследовании роста культуры получены следующие экспериментальные данные при различных начальных концентрациях субстрата:


So = 1 г/л

t, ч

0

0,05

1,33

2,30

3,74

4,85

5,79

7,48

Х, г/л

0,01

0,013

0,015

0,02

0,03

0,04

0,05

0,07

So = 3 г/л

t, ч

0

1,28

2,03

3,00

3,41

4,37

4,75

5,20

Х, г/л

0,01

0,02

0,03

0,05

0,08

0,10

0,12

0,13

So = 5 г/л

t, ч

0

1,15

2,30

3,24

3,83

4,53

5,03

5,46

Х, г/л

0,01

0,02

0,04

0,07

0,10

0,15

0,20

0,25

So = 10 г/л

t, ч

0

1,18

2,35

3,89

4,56

5,04

5,41

5,7

Х, г/л

0,01

0,02

0,04

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

So = 20 г/л

t,ч

0

1,45

2,90

4,80

6,21

7,01

7,57

Х, г/л

0,01

0,02

0,04

0,10

0,20

0,30

0,40

So = 50 г/л

t, ч

0

1,43

4,89

8,11

10,51

11,90

13,63

15,84

17,04

17,80

Х, г/л

0,01

0,015

0,04

0,10

0,20

0,30

0,50

1,00

1,50

2,00

Видно, что рост данной культуры лимитируется избытком субстрата. Определить m, Ks, Ki, если Y = 0,1.




1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница