Методические указания к практическим занятиям Красноярск сфу 2013 ббк 30. 16




Скачать 482.96 Kb.
страница2/4
Дата13.08.2016
Размер482.96 Kb.
1   2   3   4

1. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

В основе всех биотехнологических процессов лежат кинетические закономерности ферментативных реакций, процессов роста и развития культур микроорганизмов, тканей растений и животных. В связи с этим для студентов-биотехнологов важным является овладение навыками количественного описания ферментативных процессов, количественного описания и анализа кинетических закономерностей культивирования микроорганизмов, проведения биотехнологических расчётов.


1.1 Определение кинетических параметров ферментативных реакций
Многие ферментативные реакции описываются уравнением Михаэлиса-Ментен

V = Vmax S / (Ks + S), (1.1)


где V – скорость реакции, моль/л·с;

Vmax – максимально возможная скорость реакции при достаточно

высоких концентрациях субстрата, моль/л∙с;

Ks – субстратная константа (константа Михаэлиса);

S – концентрация субстрата, моль/л.

Графически уравнение Михаэлиса-Ментен имеет вид гиперболы.

Как правило, при изучении ферментативных процессов стоит задача определения констант уравнения Михаэлиса-Ментен на основе ограниченного количества экспериментальных определений скорости реакции при нескольких значениях концентрации субстрата. Для этого наиболее часто применяются графические методы определения констант, которые заключаются в том, что уравнение различными способами представляется в линейном виде.

Метод Лайнуивера и Бэрка. Уравнение Михаэлиса-Ментен можно представить в линейном виде:
1/V = (Ks/Vmax) · (1/S) + 1/Vmax). (1.2)
В координатах 1/V от 1/S (в двойных обратных координатах) уравнение (1.2) имеет вид прямой линии с тангенсом угла наклона Ks/Vmax; отрезок, отсекаемый по оси ординат, равен 1/Vmax, а отрезок, отсекаемый по оси абсцисс, равен -1/Ks. Следовательно, константы Ks и Vmax можно легко определить, если имеются надёжно измеренные скорости реакций как минимум при двух различных концентрациях субстрата.

Метод Вульфа-Августинсона-Идая. Уравнение (1.1) можно представить в виде:

V = Vmax – Ks · V/S. (1.3)


В координатах V от V/S это уравнение имеет вид прямой, тангенс угла наклона которой равен Ks; отрезок, отсекаемый по оси ординат, равен Vmax/Ks, а отрезок, отсекаемый по оси абсцисс, равен Vmax .

Уравнение Михаэлиса-Ментен в интегральной форме. Учитывая, что скорость ферментативной реакции V = -dS/dt (концентрация субстрата убывает), можно записать
-dS/dt = Vmax S/(Ks + S). (1.4)
Разделяя переменные и интегрируя в соответствующих пределах, получим уравнение Михаэлиса-Ментен в интегральной форме
(So – S)/t = Vmax + Ks/t ∙ ln(S/So). (1.5)
Это уравнение может быть использовано для определения Vmax и Ks по данным измерений, полученным в ходе реакции, если определение начальной скорости затруднено. Для этого величину S необходимо измерить через определённые промежутки времени и результаты представить в виде графика (1/t) ∙ ln(S/So) от (So – S)/t. При этом получим прямую с тангенсом угла наклона, равным -1/Ks, отсекающую по оси ординат отрезок Vmax/Ks, по оси абсцисс – отрезок Vmax.

Уравнение (1.4) является трансцендентным, поэтому его нельзя решить алгебраически относительно S, как функции времени. Однако если определены константы уравнения Михаэлиса-Ментен и известно So, то можно графически определить зависимость убыли концентрации субстрата S от времени.


1.2 Конкурентное и неконкурентное ингибирование
Уравнение Михаэлиса-Ментен для случая конкурентного ингибирования имеет вид:

V = Vmax · S/Ks (1+ i/Ki) + S, (1.6)


где i – концентрация ингибитора;

Ki – константа ингибирования.

Из уравнения (1.6) видно, что влияние конкурентного ингибитора проявляется в увеличении константы Ks в (1+i/Ki) раз, а Vmax не зависит от присутствия конкурентного ингибитора.

Для случая неконкурентного ингибирования уравнение Михаэлиса-Ментен имеет вид:


V = Vmax · S/(1+i/Ki) ∙ (Ks + S). (1.7)
Из уравнения (1.7) видно, что константа Ks не зависит от присутствия неконкурентного ингибитора, а величина Vmax уменьшается в (1+i/Ki) раз.

Для случая конкурентного ингибирования, следовательно, можно рассчитать значения констант Ks и Ksi = Ks (1+i/Ki), откуда можно найти значение константы ингибирования Ki при известной концентрации ингибитора i:


Ki = i/(Ksi/Ks) – 1. (1.8)
Для неконкурентного ингибирования Ki рассчитывают по формуле
Ki = i/(Vmax/Vmax.i) – 1, (1.9)
где Vmax.i = Vmax /(1+i/Ki).


    1. Задачи к разделу 1 «Кинетика ферментативных реакций»



Задача 1. В таблице 1 приведены результаты определения скорости гидролиза АТФ миозином в зависимости от концентрации субстрата. Определить различными графическими методами константы уравнения Михаэлиса-Ментен.
Таблица 1 – Зависимость скорости реакции гидролиза АТФ от концентрации субстрата (миозина)


S, моль/л

0,01

0,025

0,030

0,050

0,075

0,100

0,150

0,2

0,3

V, моль/л∙с

0,10

0,138

0,150

0,165

0,175

0,185

0,190

0,192

-

Задача 2. Ферментативная реакция подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Начальная концентрация субстрата So = 0,1 ммоль/л, Vmax = 0,1 мкмоль/л∙с, Ks = 0,01 ммоль/л. Определить остаточную концентрацию субстрата через 10 мин после начала реакции.

Задача 3. При концентрации субстрата 0,025 и 0,1 ммоль/л скорости ферментативных реакций составили соответственно 0,138 и 0,185 мкмоль/лс. В присутствии ингибитора в концентрации 0,001 ммоль/л скорости реакции составили при тех же концентрациях субстрата 0,164 и 0,1 ммоль/лс. Определить тип ингибирования и параметры уравнения Михаэлиса-Ментен.

Задача 4. Определить, какую долю Vmax будет составлять скорость реакции при концентрациях субстрата 0,5; 2 и 10 величин Ks.

Задача 5. Многие ферменты необратимо ингибируются ионами металлов, такими как ионы меди, серебра и другими, которые могут взаимодействовать с важными для активности ферментов сульфгидрильными группами. Сродство ионов серебра к SH-группам столь велико, что практически каждая группа связывает один ион. К 10 мл раствора, содержащего 1 мг/мл чистого фермента, добавили такое количество AgNO3, которое достаточно для полной инактивации фермента. Для этого потребовалось 0,342 мкмоля AgNO3. Рассчитать минимальную молекулярную массу фермента.

1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница