Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы) 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология




страница2/3
Дата13.08.2016
Размер0.88 Mb.
1   2   3

На плотной питательной среде с использованием солевого раствора Хенкса максимальный пик спорообразования депонированного штамма гриба C. albicans №253 зафиксирован к 12-м суткам культивирования. К этому же времени колонии гриба, представляющие собой как споры, так и псевдомицелий, имели характерный вид и были представлены клетками, обладающими высокой жизнеспособностью и выживаемостью при последующих пересевах на свежие питательные среды.

При выращивании гриба A. fumigatus шт. №6 на плотных питательных средах первые признаки развития в виде мелких полупрозрачных образований отмечали через 6-8 часов на агаре Хенкса, через 8-10 часов на агаре Сабуро и Чапека и через 12-14 часов на дрожжевом агаре.

В бульонах первые признаки роста гриба отмечали при культивировании на питательном субстрате Сабуро через 14-18 часов, дрожжевом и Хенкса – через 18-22 часа, на Чапека – через 24-28 часов после посева.

После первых 3-6-ти суток культивирования наиболее интенсивный процесс спорообразования идет на среде Сабуро. Однако к 9-м суткам по формированию спор уже бульон Хенкса превосходит все остальные среды. В этот же период зафиксирован первый пик максимального спорогенеза на бульонах Сабуро и Хенкса. Второй пик спорообразования на этих же средах отмечается к 12-м суткам (увеличение количества спор в 2 и 2,5 раза соответственно). Во все последующие временные отрезки уровень спорогенеза и его стабильность наиболее высоки на бульоне Хенкса.

Исследования по динамике спорогенеза на плотных питательных средах показали, что культивирование аспергилл на агарах способствует большему «урожаю» спор, но меньшему выходу мицелиальной массы.

Максимальное количество спор образуется уже к шестым суткам культивирования на всех испытуемых средах, за исключением дрожжевого агара, где пик спорообразования отмечен на 18-е сутки. Фаза максимального спорогенеза на агаре Чапека продолжается 12 суток, на Сабуро и Хенкса – 9 дней, на Дрожжевой среде - трое суток. Пиковые значения формирования спор затем сменяются фазой угнетения спорогенеза и одновременным прекращением роста и развития мицелия, что в первую очередь связано с постепенным обеднением среды и накоплением продуктов метаболизма гриба. На некоторых средах (Сабуро, Хенкса) зафиксирована повторная «вспышка» спорообразования на 33-36-е сутки культивирования с последующим резким снижением количество спор и визуально заметной инволюцией мицелия, что связано с тотальным обеднением питательных свойств субстрата.

Таким образом, при сравнении характера роста по признакам спорогенеза и формированию мицелия на жидких и плотных питательных средах можно сделать вывод, что агаризованные среды способствуют как спорогенезу, так и накоплению грибницы. Однако, при культивировании аспергилл в бульонах процесс спорообразования идет более плавно, как при достижении пиковых значений (на Сабуро к 15-м суткам, на других средах к 21-му дню), так и при понижении уровня спорогенеза. Кроме того, продукты метаболизма и аутолизиса гриба, на плотных средах диффундируют в агар, тогда как в бульонах они всегда остаются в составе культуральной жидкости.

Анализ выживаемости и жизнеспособности спор A. fumigatus №6 на 30-е сутки в сравнении с пиковыми значениями спорогенеза дал следующие результаты.

На агаре Чапека живых спор было - 12%, на дрожжевом – 17%, Сабуро – 39%, Хенкса – 48%. Жизнеспособность спор в на свежей аналогичной среде отмечена во всех случаях до разведении 10-5 включительно.

На бульоне Чапека сохранность спор составила 15%, на дрожжевом – 23%, на Сабуро – 48%, на Хенкса – 56%. Жизнеспособность спор проявлялась до разведения 10-5 на всех испытуемых средах.

При культивировании гриба M. racemosus №195 на плотных питательных средах визуальное проявление начала формирования колоний происходило следующим образом: на дрожжевом агаре – через 8-10 часов после посева, на Сабуро и Хенкса – через 10-12 часов, на Чапека – через 16-18 часов. Скорость формирования грибницы проходила аналогичным образом. Сохранность спор гриба также зависела от питательного субстрата и составляла 13%; 45%; 51% и 46% на агаре Чапека, Сабуро, дрожжевом и Хенкса соответственно. Жизнеспособность спор была на уровне результатов, полученных в опытах по культивированию аспергилл.

Визуально начало развития гриба M. racemosus в бульонах характеризовалось помутнением среды и образованием культуральной пленки. На среде Чапека через 22-24 часа, Хенкса 16-20 часов, Сабуро – 12-14 часов, дрожжевой – 10-12 часов. Сохранность спор в бульонах составляла на среде Чапека – 14%, на Сабуро – 43%, на Дрожжевой и Хенкса – 50-51%. Показатель выживаемости имел значение – 10-5.

Полученные результаты наблюдений по другим культуральным свойствам грибов так же, прямо или косвенно, подтверждают оптимальность той или иной питательной среды. Однако, исходя из поставленной задачи – получение высокоактивных антигенов оптимальными питательными средами были признаны субстраты Сабуро и приготовленные на основе растворов Хенкса. Данные среды наиболее универсальны и позволяют в более короткие сроки и с большей долей постоянства получать клетки грибов (обильную мицелиальную массу с достаточно высоким выходом спор). Применение этих же сред для хранения штаммов грибов позволяет проводить пересевы не чаще одного раза в месяц с сохранением достаточной степени жизнеспособности и выживаемости клеток грибов.

При изучении влияния объемов питательных сред на рост и развитие грибов, что в пробирках уже через 20-24 часа происходит образование поверхностной культуральной пленки. Количество спор увеличивается постепенно. После 68-72 часов культивирования отмечается резкая скачкообразная вспышка спорогенеза с интенсивным развитием мицелия, особенно в 48-56 часовых культурах.

При культивирование грибов в бутылях отмечена задержка формирования культуральной пленки на 12-16 часов и интенсивный спорогенез (до 6-х суток у мукора и до 9-ти – у аспергилл), по сравнению с малыми (пробирочными) объемами.

Таким образом, существенное влияние на характер роста и направленность метаболизма оказывают не только состав и агрегативное состояние питательных сред, но и их объемы.

Получение антигенов из культур грибов: С. albicans, A. fumigatus и

M. racemosus

Установлено что самым эффективным и щадящим является способ разрушения клеток грибов ультразвуковой дезинтеграцией. Использование дезинтегратора с воздействием ультразвуковых волн в пределах 10-20 кГц, экспозиции 10-60 мин, в зависимости от объема культуральной жидкости, позволяло разрушать не менее 90% клеток грибов Candida и 50-60% - Aspergillus и Mucor. После разрушения мембран грибов для освобождения от поврежденных стенок и целых клеток использовали мембранные пластины типа «Владипор – МФА №3».


Разработка способа лабораторной оценки антигенов культур грибов

C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 реакцией специфической агломерации лейкоцитов

Способ оценки иммуногенности культур грибов и антигенов из них, с использованием реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) основана на усилении склеивания (агломерирования) лейкоцитов крови донора при внесении антигена in vitro. Феномен агломерации, как и усиление амебовидной подвижности нейтрофилов, является первой фазой реакции клеток белой крови на антиген.

Методика постановки РСАЛ включает в себя несколько этапов. Вначале проводят подбор животных – доноров крови, с наименьшей естественной (физиологической) агломеративной способностью. Стабилизированную кровь разливают по 0,2 мл в пробирки Флоринского, добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки в рабочем разведении 1:20, встряхивают и инкубируют при 370С в течение 1 часа.

Кровь из пробирок наносят на предметные стекла и делают тонкие мазки, которые подсушивают при комнатной температуре и фиксируют в метиловом спирте не менее 3 минут. Зафиксированные мазки окрашивают 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут. Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 в нескольких полях зрения и подсчитывают не менее 1000 лейкоцитов, учитывая при этом количество склеенных (агломерированных) клеток белой крови. Для каждого животного подсчитывают не менее 5 мазков.

Агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Кролик, кровь которого обладает наименьшей естественной агломерированной способностью, но не более 4%, используется в качестве донора. Кровь кролика-донора в последующем используют для иммунологической оценки культур грибов по индексу агломерации лейкоцитов.

Предварительно суспензии культур грибов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки спор и мицелия ультразвуком. Антигены в объеме 0,04 мл вносят в стабилизированную кровь и выполняют вышеописанные действия, с обязательной постановкой контролей. Контролями служат параллельная постановка реакций:

a) со стабилизированной кровью донора, антигеном, а вместо комплемента – физиологический раствор хлорида натрия.

б) стабилизированная кровь донора, комплемент, а вместо антигена – физиологический раствор хлорида натрия. При этом индекс в РСАЛ (А и Б) не должен превышать 4%.

Исследованиями антигенов культур грибов C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 установлено, что агломеративная способность лейкоцитов при постановке реакции подвержена колебаниям в зависимости от возраста культур и плотности используемых для их выращивания питательных сред (бульоны или агары). Так для получения антигенов из грибов Candida предпочтительней использовать агаризованную среду с компонентами солевого раствора Хенкса, а для продуцирования иммуноактивных АГ грибов Aspergillus и Mucor – бульоны Хенкса. Низкий уровень агломерации лейкоцитов отмечен в пробах культур C. albicans шт. №253 с АГ 5, 6, 9, 12 и 18-ти суточных агаровых культурах. Наиболее низкий индекс зафиксирован в РСАЛ с АГ 6-ти суточной культурой – 6,0%. Наименьший показатель в РСАЛ отмечен у АГ 5-9 суточных бульонных культур – 7-8%. При постановке реакции с АГ агаровых культур аспергилл и мукора индекс агломерации лейкоцитов находился в пределах 9-32%, что значительно выше, чем у грибов Candida. Однако, АГ аспергилл, извлеченные из 15-ти суточных бульонных культур имели показатели в РСАЛ – 7,9%, а АГ гриба Mucor в 12-ти суточных культурах всего 6,9%.
Конструирование иммуногенных и аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов: C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6),

M. racemosus (шт. №195)

Значительный разброс в показателях агломеративной способности грибов свидетельствовал об изменении антигенного состава кандиды, аспергилл и мукора в зависимости от возраста культур. Поэтому следующим этапом исследований было изучение иммуногенных и аллергогенных свойств АГ грибов с учетом значений индекса в РСАЛ.

С этой целью готовили препараты из АГ, давшие наименьшие и наибольшие показатели в РСАЛ. Для получения иммуногенных препаратов АГ подвергали воздействию формальдегида в 0,4% концентрации в течение 3-х недель. При изготовлении аллергенов АГ консервировали 0,25% раствором фенола.

Исследования препаратов кожно-аллергической пробой проводили на кроликах, зараженных теми или иным возбудителям висцеральных микозов. Аллергены вводили внутрикожно на 3-6 день после заражения. Учет реакции проводили через 24, 48 и 72 часа после введения аллергенов. АГ, имевшие в РСАЛ наиболее высокий индекс (свыше 20%), у больных аспергиллезом давали увеличение кожной складки 6-11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом 5-9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза – 3-4 мм. Использование в качестве аллергенов АГ с показателями в РСАЛ ниже 15% давало слабо выраженную реакцию, проходящую в течение 24 часов.

Внутримышечное введение препаратов, приготовленных по технологии вакцин из АГ, имевших различный индекс в РСАЛ, дало прямо противоположные результаты. АГ, имевшие показатели в РСАЛ от 6 до 16%, обладали наибольшей иммуногенной активностью, обеспечивая при этом высокий уровень защиты кроликов и морских свинок при их последующем контрольном заражении.

Следует подчеркнуть, что величина индекса в РСАЛ в 6-% получена при культивировании C. albicans шт. №253 на агаре Хенкса в течение 6-ти суток при t0 280C, а A. fumigatus шт. №6 и M. racemosus № 195 при выращивании их в бульоне Хенкса при t0C 370С в течение 15 и 12 суток соответственно (в матрасах и бутылях).

Таким образом, исходя из вышеизложенного, АГ грибов Candida (шт. №253) при величине индекса агломерации в РСАЛ (6-10%) проявляли иммуногенные свойства, АГ грибов Aspergillus (шт. №6) при 6-16%, АГ грибов Mucor (шт. №195) при показателях в 6-15%. При величине в РСАЛ свыше 16%, вакцинные свойства грибов снижались, а их аллергенная активность наоборот возрастала.

Технология получения иммуногенных препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и M. racemosus (шт. №195)
В результате проведенных исследований разработана унифицированная технология изготовления противомикозных вакцин.

Получение вакцины против кандидоза и оценка ее иммуногенности


  1. Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Затем культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают на матрасы с питательным агаром, приготовленным с использованием солевого раствора Хенкса. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 6-ти суток. Полученную культуру смывают дистилированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор (обычно колеблется в пределах 8х108-1х109спор/см3). Концентрацию спор затем доводят до 4,5х108-5,5х108 м. т. в см3 дистиллированной водой.

  2. Выделяют АГ из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии гриба, используя метод разрушения микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора больших объемов – «Solana» (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуумнасоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белковополисахаридных антигенов.

  3. Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл антигенсодержащего материала и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 370С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, а вместо комплемента - тот же объем физиологического раствора и стабилизированную кровь кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплемент морской свинки и изотонический раствор хлорида натрия, вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 370С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают, а затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают при увеличении микроскопа х450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных в конгломерат в количестве не менее 3). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 10% от общего числа подсчитанных 100, АГ считаются потенциально иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы по созданию вакцины.


  1. К АГ, имеющим индекс в РСАЛ 6-10%, добавляют формалин в конечном разведении смеси – 0,4%.

  2. В АГ – формалиновый комплекс вносят адъювант – 6% раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.

  3. Комплекс: АГ – формалин – адъювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 370С в течение 21 суток.

  4. На конечном этапе проводят оценку иммуногенных свойств вакцины.

Для этого полученный препарат вводят в дозе: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – 1,5 мл внутримышечно. Вакцину вводят двукратно с 7-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Оценку напряженности иммунитета проводят с использованием внутривенного заражения для кроликов и мышей и внутрисердечного для свинок. Для заражения используют бласто- и хламидоспоры трехсуточной вирулентной культуры C. albicans с концентрацией 3х109спор в 1см3 и объеме: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – по 1 мл.

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО «Аквапласт» (г. Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС-1:3125.

Получение вакцины против аспергиллеза и оценка ее иммуногенности

Технология приготовления вакцины против аспергиллеза аналогична способу получения противокандидозного препарата, за исключением:



  1. Используется штамм гриба A. fumigatus №6, который вначале также засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 370С в течение 3-х суток. Количество засеваемых пробирок делается из расчета – 1 пробирка на 1 литр бульона, приготовленного на растворе Хенкса. Дальнейшее культивирование проводят в 10-ти литровых микробиологических бутылях при t0 370C в течение 15-ти суток. Определяют концентрацию спор. «Урожай» спор обычно достигает: 2,5-3,0х108 клеток на 1см3.

  2. Выделение АГ аналогично описанному в получении АГ из грибов Candida.

3. Ход проведения оценки полученных АГ идентичен описанному при анализе АГ грибов Candida. Однако АГ считаются иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы при индексе в РАЛ от 6 до 16%.

  1. К АГ, имеющим агрегативную способность 6-16%, добавляют формалин.

  2. Аналогично, как и при приготовлении вакцины против кандидоза.

  3. Аналогично, кандидозной вакцины.

  4. Оценка иммуногенных свойств вакцины. Вакцину вводят кроликам внутримышечно в дозе 2,5 мл двукратно с 8-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации. Учитывая, что в естественных условиях возбудитель аспергиллеза проникает в организм алиментарным путем, поражая при этом органы пищеварительного тракта, оценку напряженности иммунитета проводят с использованием перорального заражения кроликов, вакцинированных по описанной выше схеме. С помощью интрагастрального зонда в желудок кроликов вводят культуру вирулентного штамма A. fumigatus с концентрацией возбудителя 1,0х106спор/см3 и в объеме вводимой суспензии клеток гриба – 10,0 мл.

У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, расстройство пищеварения, явления угнетения нервной системы) проявляются через 3-4 суток после заражения. Гибель интактных кроликов наступает через 3-6 суток после появления первых клинических признаков болезни. У вакцинированных животных клинические симптомы заболевания отсутствуют.

Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят также с использованием РП и ИФТС. Кровь для исследований берут от иммунизированных и для контроля от интактных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС - 1:3125.



Получение вакцины против мукороза и оценка ее иммуногенности

Технология приготовления вакцины против мукороза во многом аналогична способу получения противоаспергиллезного препарата. Однако имеются и различия:

1. Используется штамм гриба M. racemosus №195. После культивирования в бульоне Хенкса в течение 12-ти суток «урожай» спор обычно колеблется в пределах 0,5-0,6х106спор/см3.

2, 3, 4, 5 и 6 этапы выполняются аналогично описанным в способе приготовления вакцины против аспергиллеза.

7. Оценку иммуногенных свойств полученного препарата проводят на кроликах. Вакцину вводят внутримышечно двукратно в дозе 2,5 мл. Интервал между введениями 7-10 дней. Напряженный иммунитет наступает через 2 недели после реиммунизации. Контрольное заражение проводят перорально культурой вирулентного штамма M. racemosus c концентрацией спор возбудителя 1,0х106спор/см3 и в объеме вводимой суспензии клеток гриба – 10,0 мл.

У невакцинированных животных клинические признаки заболевания (отказ от корма, диарея, симптомы расстройства в центральной нервной системе и т.д.) проявляются на 5-7 сутки после заражения. Гибель животных на 10-20 сутки после появления признаков заболевания. У вакцинированных животных признаки болезни отсутствуют или проявляются снижением аппетита и быстропроходящей диареей).

Серологическую оценку гуморального иммунитета проводят постановкой только РП из-за отсутствия других методов. РП с сывороткой крови иммунизированных животных достигает значений 1:8 - 1:16, а интактных - не выше 1:4.

Антигены, использованные для конструирования кандидозной, аспергиллезной и мукорозной вакцин были подвергнуты биохимическим исследованиям. Результаты исследований представлены в таблицах 2.2-2.4.


Таблица 2.2.



Характеристика антигенов грибов по липидному составу

п.п.

Наименование и состав компонентов


Антигены

A. fumigatus №6

M. racemosus №195

C. albicans №253

1.

Общее содержание липидов, %

2,24

2,05

0,22

Содержание кислот в % к общим липидам

2.

Линолевая кислота

1,50

11,5

2,05

3.

Линоленовая кислота

5,31

3,77

5,22

4.

Олеиновая кислота

76,8

66,5

76,2

5.

Насыщенные кислоты

17,9

14,7

15,8

Таблица 2.3.



Характеристика антигенов грибов по составу углеводов


п.п.


Наименование углеводов

Антигены

количество углеводов, мг%

A. fumigatus №6

M. racemosus №195

C. albicans №253

1.

Моносахариды

0,24

49,1

49,5

2.

Дисахариды

1395

1379

14,0

3.

Полисахариды

н/о

н/о

76,0

Таблица 2.4.



Характеристика антигенов грибов по полипептидному составу


п.п.




Наименование компонентов



Антигены

A. fumigatus №6


M. racemosus №195


C. albicans №253

Состав компонентов, мг %

1.

Общий азот

31,2

28,8

3,7

2.

Полипептиды с

М. м. > 10 кД

134,2

12,4

86,4

3.

Полипептиды с

М. м. 5,0 – 10 кД

8,1

7,1

1,1

4.

Полипептиды с

М. м. 1,5-5,0 кД

20,0

21,4

2,5

5.

Полипептиды с

М. м. < 1,5 кД

142,8

128,5

17,1

Белки антигенов гриба A. fumigatus шт. №6 имели основные пептиды с М. м. 15,25,35,75 и 100 кД.

В антигенах грибов M. racemosus №195 превалировали белковые структуры с М.м. 75-50 кД., а также незначительное количество с М. м. 25 кД.

Белки грибов C. albicans шт. №253 были представлены в основном полипептидами с молекулярной массой 75 кД.

В исследованных образцах большее количество пептидов приходилось и на низкомолекулярные соединения (М.м.<1500Д и от 1500 до 5000Д).
Технология получения аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и

M. racemosus (шт. №195) и испытание их на лабораторных животных.

При проведении сравнительной оценки спорообразования было установлено, что максимальное количество спор при культивировании C. albicans (шт. №253) формировалось к 18-21-м суткам (2х109спор/см3), A. fumigatus (шт. №6) к 6-9-м суткам (3х108спор/см3) и M. racemosus (шт. №195) к 18-м суткам (8х107спор/см3). В указанные сроки коэффициент РСАЛ у всех изучаемых грибов достигал значений не менее 21-23%.



Получение кандидозного аллергена

  1. Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Выросшую культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают в матрасы также с агаром Сабуро. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 18-21-х суток. Полученную культуру смывают дистиллированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор. Количество спор обычно колеблется в пределах 2 млрд 100 млн – 2 млрд 200 млн спор/см3.

  2. Выделяют АГ используя ультразвуковой дезинтегратор. Воздействие дезинтегратора осуществляют при длине волны 20 кГц и экспозиции 90 минут. Освобождение от разрушенных и неразрушенных вегетативных и споровых клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор МФА-МА №3» при помощи вакуум насоса. Отфильтрованный дезинтеграт содержит АГ гриба.

  3. Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов. При наличии агломерированных лейкоцитов не менее 20% и выше АГ считаются аллергенными.

  4. К АГ, имеющим коэффициент в РСАЛ 20% и выше, добавляют в качестве консерванта раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

  5. На конечном этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на белых мышах.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом C. albicans в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно с внутренней стороны бедра в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят через 24-48 и 76 часов. В качестве контроля используют интактных животных. У зараженных возбудителем кандидоза мышей через сутки отчетливо выражена гиперемия, повышенная температура кожи в месте введения аллергена и увеличение кожной складки на 1-3 мм, которая сохраняется не менее трех суток. У интактных мышей через 24 часа на месте введения аллергена реакция отсутствует.
Получение аспергиллезного аллергена

Технология приготовления аспергиллезного аллергена аналогична способу получения кандидозного препарата за исключением:



  1. Используется штамм гриба A. fumigatus № 6, который вначале также на 3-е суток засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют при 370С, а затем в матрасах в течение 6-9 суток и достижения «урожая» спор 300 млн клеток/см3.

2-3 п.п. Выделение АГ и их оценку проводят аналогично описанному выше при работе с грибом C. albicans.

  1. К АГ с коэффициентом в РСАЛ 20% и выше в качестве консерванта вносят раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

  2. На последнем этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на лабораторных животных.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом A. fumigatus в дозе 1х106спор/см3 в объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично описанному при испытании кандидозного аллергена.

Получение мукорозного аллергена

  1. Используется штамм гриба M. racemosus №195. Полученный посевной материал после трехсуточного культивирования при 370С в пробирках засевают в матрасы и инкубируют еще 18 суток. Концентрация спор к этому времени достигает 80 млн клеток/см3.

2-4 п.п. Выполняются аналогично описанным при работе с грибами

C. albicans и A. fumigatus.

5. Оценку аллергенных свойств полученного препарата проводят также с использованием белых мышей. Для этого на 3 суток после внутрибрюшинного заражения вирулентным штаммом M. racemosus в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген белым мышам вводят в дозе 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично кандидозного аллергена. Биохимический состав аллергенов представлены в таблицах 2.5-2.6.

Таблица 2.5.



Характеристика антигенов (аллергенов) грибов по составу полипептидов

п.п.


Наименование компонентов

C. albicans, шт. №253

A. fumigatus, шт. №6

M. racemosus, шт. №195

количество, мг%

1

Общее содержание азота

10,7

64,3

59,1

2

Полипептиды с Мм > 250 кД

51,4

156,3

149,1

3

Полипептиды с Мм 150-250 кД

31,6

53,1

49,4

4

Полипептиды с Мм 50-150 кД

2,6

4,3

4,1

5

Полипептиды с Мм < 50 кД

0,8

2,0

1,4

Таблица 2.6.

Состав и свойства аллергенов грибов

Род, вид и штамм гриба

Общее содержание липидов, %

Соотношение белок/углеводы

C. albicans, шт. №253

0,29

1/4

A. fumigatus, шт. №6

12,6

1/3

M. racemosus, шт. №195

11,4

1/2

Антигены гриба C. albicans (шт. №253) отличаются от АГ плесневых грибов (M. racemosus шт. №195 и A. fumigatus шт. №6) по общему содержанию белкового азота. Соотношение же полипептидов с различной молекулярной массой (М.м.) примерно равное у АГ всех грибов. Основные пептиды аллергенов имеют М.м. > 250 кД.

В составе аллергенов как дрожжеподобных, так и плесневых грибов отмечено повышенное содержание липидных компонентов.

При отработке дозы внутрикожно вводимых аллергенов было установлено, что оптимальный объем - 0,2 мл. При этой дозе отчетливая кожно-аллергическая реакция проявляется в 100% случаев у зараженных возбудителем того или иного микоза. Постановка кожно-аллергических проб возможна уже на 2-3 сутки после заражения. Учет реакции можно проводить через 24 часа после инъецирования аллергенов. Оптимальный срок – 48-72 часа.

У больных аспергиллезом кроликов увеличение кожной складки варьирует от 6 до 11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом от 5 до 9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза от 3 до 6 мм. У ммунизированных мукорозной и аспергиллезной вакциной кожно-аллергическая проба (КАП) тоже дает положительную реакцию, проявляющуюся увеличением складки на 3-4 мм. У кроликов, иммунизированных противокандидозным препаратом, реакция на введение аллергена выражается покраснением, повышением местной температуры и незначительным увеличением кожной складки. Аллергическая реакция у вакцинированных тем или иным препаратом кроликов сохраняется не менее трех месяцев после иммунизации. Перекрестное введение аллергенов не давало ложноположительных результатов. У кроликов с хроническим течением микозов КАП проявлялся в течение двух месяцев болезни. У клинически здоровых животных испытуемые аллергены не давали положительных реакций.
Изучение аллергенных, пирогенных и реактогенных свойств противогрибковых вакцин

Для изучения пирогенных и реактогенных свойств вакцин, тест-дозу в объеме 1 см3 вводили внутривенно (Г.Ф. ХI, выпуск 2, с. 183).

Испытания проводили на 15 клинически здоровых кроликах. Вакцины вводили в краевую ушную вену. Разница в температурах до введения препаратов и после не превышала ±0,2оС на всем протяжении испытаний.

Реактогенность препаратов определяли методом клинических визуальных наблюдений и исследований. Отклонений от физиологических показателей отмечено не было.

Аналогичные исследования проводились на 20 клинически здоровых телятах и 60 поросятах. Возраст телят от 1 до 4-х месячного, поросят - 1-3 месяца.

Аллергенность препаратов изучали внутрикожным введением в дозах от 0,1 до 0,5 мл. Пирогенные и реактогенные свойства экспериментальных вакцин изучали внутривенным введением в дозе 1 см 3.

После внутривенного введения вакцин, каких-либо изменений в состоянии животных, а также в их поведении не отмечали. Динамика нарастания массы тела животных в опытных и контрольных группах не различались. Физиологические показатели животных (температура тела, пульс, частота дыхания, а также частота сокращения рубца у телят), опытных групп соответствовали контрольным. Гибели животных опытных групп не отмечали.

Однократное подкожное и внутримышечное введение телятам (возраст 3 мес.) кандидозной вакцины в дозе от 1 до 10 мл., и поросятам (возраст 4 мес.) в дозе от 1 до 5 мл., а также аспергиллезной и мукорозной вакцины в дозе от 1 до 5 мл., изменений в физиологических показателях и поведении не вызывало.

Установлено, что подкожное инъецирование в отдельных случаях вызывает припухлость в месте введения препаратов, которая исчезает в течение 6-12 часов при использовании объемов вакцин менее 5 мл. и в течение 18-24 часов при дозе от 5 до 10 мл.

Двух- и трехкратное инъецирование препаратов с интервалом между введениями в 5 - 10 дней телятам в дозе от 1 до 5 мл. в возрасте 1 – 4 мес. (ж.м. 30 - 60 кг.), а также поросятам в дозе от 1 до 3 мл. в возрасте 1 – 2 мес. (ж.м. от 6 до 30 кг), реактогенностью, пирогенностью и аллергенностью не обладало.


Гематологические, иммунологические и биохимические показатели у лабораторных и сельскохозяйственных животных, вакцинированных противокандидозными, противоаспергиллезными и противомукорозными препаратами.
Исследования крови кроликов проводили до вакцинации и через 14 дней после реиммунизации. Вакцины вводили внутримышечно в дозах – 1,5 мл. Интервал между вакцинациями – 7- 10 дней.

Установлено, что изменения после введения кандидозной вакцины характеризуются повышением количества: гемоглобина на 8 г/л, лейкоцитов на 0,8х109/л; увеличением относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов с 4,6 до 5,8%, моноцитов с 2,8 до 3,4%, при снижении количества эозинофилов с 2,2 до 1,6% и базофилов – до 0 (не определены).

Изменение тех же показателей крови кроликов после реиммунизации аспергиллезной вакциной имели аналогичный характер: увеличение содержания гемоглобина на 8 г/л, количества лейкоцитов – на 1,0х109/л, моноцитов с 4,8 до 6,0% и снижение эозинофилов с 2,2 до 1,8%.

После вакцинации кроликов мукорозной вакциной обнаружено достоверное увеличение содержания гемоглобина крови на 5 г/л, лейкоцитов на 0,7х109/л, моноцитов с 6,2 до 7,6% и снижение содержания эозинофилов с 2,2 до 1,8%.

Иммунологические и биохимические исследования крови кроликов после вакцинации противокандидозными препаратами характеризовались повышением общего количества Т-лимфоцитов – на 7,6%, Т-активных клеток – на 7,2%, Т-хелперов – на 9,6%, ЦИКов – на 4 у.е., снижением Т-супрессоров – на 2%. Отмечено падение уровня альбуминов – на 13%, при соответствующем возрастании глобулиновой фракции (13%), -глобулинов - на 3,6%, -глобулинов – на 7,8%. После двукратной иммунизации кроликов аспергиллезной вакциной изменения иммунологических и биохимических показателей были следующими: отмечено увеличение содержания Т-лимфоцитов – на 7,8%, Т-активных – на 7,8%, Т-хелперов – на 10,6%, соотношение Т-х/Т-с возрастало на 3,2%, ЦИКов – на 3,2% при снижении Т-супрессоров на 3,0%.

Изменение соотношения белковых фракций выражалось в снижении альбуминов – на 9,8%, с соответствующим увеличением глобулинов – 9,8%, -глобулинов - на 4,0%, -глобулинов – на 6,0%.

Биохимические показатели крови после иммунизации мукорозной вакциной были следующими: снизилось содержание альбумина на 14,2% и соответственно увеличилось относительное содержание глобулинов: -глобулинов - на 3,8%, -глобулинов – на 9,8%.

Иммунологические показатели в поствакцинальном периоде: общее содержание Т-лимфоцитов возросло на 5,8%, Т-активных – на 12,8%, Т-хелперов – на 11,8%, ЦИКов – на 4,0у.е.; снизилось содержание Т-супрессоров на 5,8%; соотношение Т-х/Т-с увеличилось на 5,0 единиц.

Иммунологические и биохимические показатели крови морских свинок, иммунизированных противокандидозными препаратами, выражались увеличением общего количества Т-лимфоцитов - на 8,8%, Т-активных – на 6,6%, В-лимфоцитов – на 4,4%. Биохимическими исследованиями зафиксировано снижение уровня альбуминов – на 6,6%, увеличением общего белка плазмы – на 5,6%, -глобулинов – на 6,6% и -глобулинов – на 6,0%.

После двукратной иммунизации морских свинок аспергиллезной вакциной отмечено нарастание общего количества Т-лимфоцитов – на 5,8%, Т-активных - на 7,2%. В биохимических показателях крови произошло снижение альбуминовой фракции на 10,4% при одновременном увеличении глобулинов (-глобулинов - на 2,4%, -глобулинов – на 4,8%.

Анализ полученных данных свидетельствует об активизации иммунокомпетентных клеток после введения как кандидозной, так и аспергиллезной и мукорозной вакцины. Повышение уровня -глобулиновой фракции подтверждает наличие иммуногенных свойств препаратов. Низкий уровень эозинофилов свидетельствует об отсутствии аллергенности препаратов.

Влияние двукратного внутримышечного, с интервалом между инъекциями в 7 дней в дозах 3-5,0 мл. противомикозных вакцинных препаратов на гематологические ииммунологические показатели клинически здоровых телят представлены в табл. 2.7.

Приведенные данные свидетельствуют, что препараты, приготовленные из грибов Candida, Aspergillus и Mucor стимулируют иммунную систему клинически здоровых телят.

Таблица 2.7.



Результаты гематологических и иммунологических исследований



Группы телят

Показатели

эритроциты 1012

лейкоциты 109

гемоглобин, г/л

общ. лимфоциты, 109

Т-лимфоциты, %

В-лимфоциты, %

До введения препаратов

5,85+

0,28

6,5+

0,52

113,4+

4,6

4,22+

0,41

11,2+

0,85

2,22+

0,16

После введения кандидозного препарата

6,87+

0,25

7,9+

0,43

113,8+

0,42

5,6+

0,47

13,9+

0,92

3,34+

0,18

После введения аспергиллезного препарата

7,1+

0,33

8,3+

0,55

113,4+

4,2

5,8+

0,46

14,6+

1,22

3,51+

0,23

После введения мукорозного препарата

7,05+

0,28

8,25+

0,53

113,6+

4,9

5,62+

0,54

14,43+

1,24

3,46+

0,27

Отмечается как абсолютное увеличение лимфоцитов (от 32,7 до 37%), так и Т-лимфоцитов (от 24 до 30%) и В-лимфоцитов (от 50,4 до 58%). Количественное увеличение лейкоцитов (от 21,5 до 27%) также свидетельствует о повышении резистентности животных. Отмечается и незначительное увеличение количества эритроцитов (от 17,4 до 20,5%), однако, содержание гемоглобина крови при этом не меняется.


Испытание экспериментальных вакцин и аллергенов, полученных из грибов в условиях хозяйств, неблагополучных по кандидозу, аспергиллезу и мукорозу сельскохозяйственнных животных.

Испытания экспериментальных вакцин проводились в хозяйствах, где ранее на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и микологических исследований патматериала и кормов был поставлен диагноз – висцеральный микоз той или иной этиологии.



Аналогично экспериментам, поставленным на морских свинках и кроликах, препараты против кандидоза, аспергиллеза и мукороза испытывались на сельскохозяйственных животных с использованием различных доз, путей введения (подкожный и внутримышечный), и кратности (одно, двухкратно), с интервалом между инъекциями в 7 – 10 дней. Экспериментальные вакцины испытывались на клинически здоровых, больных и подозрительных в заболевании телятах и поросятах 1 – 5 месячного возраста (табл. 2.8-2.10).
Таблица 2.8.

Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противокандидозной вакциной



Вид и возраст животных




Доза, мл



Способ введения

Титры АТ в ИФТС:



до иммунизации (контроль)


после 1-й иммунизации


после 2-й иммунизации


Телята (1-2 мес.)




1,0 – 3,0

п/к



1:400

1:800

1:1600

в /м


1:800

1:1600



Телята (2-3 мес.)



2,0 – 4,0

п/к



1:400

1:800

1:1600

в/м


1:1600

1:1600


Телята (3-5 мес.)



5,0 – 10,0

п/к



1:400

1:800

1:1600

в/м


1:1600

1:3200


Поросята (1-2 мес.)



1,0 – 2,0

п/к



1:400

1:800

1:1600

в/м


1:1600

1:3200

Таблица 2.9.



Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противоаспергиллезной вакциной


Вид и возраст животных


Доза, мл


Способ введения

Титр АТ в ИФТС:

до имм-ции (контроль)

после 1-й имм-ции (опыт)

после 2-й имм-ции (опыт)


Телята (1-2 мес.)


1,0 – 2,0

п/к


1:400

1:800

1:1600

в/м

1:800

1:1600


Телята (2-3 мес.)


2,0 – 3,0

п/к


1:400

1:800

1:1600

в/м

1:1600

1:3200


Телята (3-5 мес.)


3,0 – 5,0

п/к


1:400

1:1600

1:3200

в/м

1:1600

1:3200


Поросята (1-2мес.)


1,0 – 2,0

п/к


1:400

1:800

1:1600

в/м

1:800

1:1600


Поросята (2-4 мес.)


2,0 – 3,0

п/к


1:400

1:1600

1:3200

в/м

1:1600

1:3200

Таблица 2.10.



Оценка способов и кратности иммунизации сельхозживотных противомукорозной вакциной



Вид и возраст животных



Доза, мл


Способ введения

Титр АТ в РП:

до иммунизации (контроль)

после 1-й иммунизации (опыт)

после 2-й иммунизации (опыт)


Телята (1-2 мес.)


1,0 – 2,0

п/к


1:2

1:4

1:8

в/м

1:4

1:8


Телята (2-3 мес.)


2,0 – 3,0

п/к


1:2

1:4

1:8

в/м

1:8

1:16


Телята (3-5 мес.)


3,0 – 5,0

п/к


1:2 – 1:4

1:8

1:16

в/м

1:8

1:16


Поросята (1-2 мес.)


1,0 – 2,0

п/к


1:2

1:4

1:8

в/м

1:4

1:8


Поросята (2-4 мес.)


2,0 – 3,0


п/к, в/м


1:2 – 1:4


1:8


1:16

Примечание: п/к – подкожно; в/м – внутримышечно
Результаты испытаний противомикозных вакцин показали, что однократная иммунизация повышает уровень специфических АТ в 2 раза. Ревакцинация с интервалом между введениями в 7 – 10 дней повышает титр АТ до значений 1:1600 – 1:3200 при иммунизации кандидозной и аспергиллезной вакцинами (в контроле 1:400), а также мукорозной до разведений 1:8 – 1:16 (контроль 1:2 – 1:4). Наиболее предпочтительный способ введения внутримышечный, так как максимальные титры специфических АТ 1:3200 в ИФТС и 1:16 в РП на 14 день после ревакцинации были получены при данном способе иммунизации. Титры специфических АТ сохранялись на указанном выше уровне не менее 3-х месяцев (срок наблюдения).

В результате приведенных исследований установлено, что в зависимости от возраста и вида животных оптимальными дозами являются: противокандидозная вакцина телятам в возрасте: 1–2 месяца – 1–2,0 мл; 3-5 месяцев – 5,0 мл; поросятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 2-4 месяца – 3,0 мл; противоаспергиллезная и противомукорозная вакцины телятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 3-5 месяцев – 3,0 мл; поросятам в возрасте: 1-2 месяца – 1-2,0 мл; 2-4 месяца – 2,0 мл.

После проведения массовой иммунизации молодняка случаи возникновения заболеваний прекращались на период до 6 месяцев (срок наблюдений).

Испытания экспериментальных аллергенов проводились на клинически здоровых, спонтанно заболевших кандидозом, аспергиллезом и мукорозом телятах и поросятах, а также животных с клиническими признакими расстройства пищеварения невыясненной этиологии. Результаты испытаний аспергиллезного аллергена представлены в табл. 2.11.


Таблица 2.11.

Реакция на введение аспергиллезного аллергена



Группы животных


Вид животных


телята


поросята


увеличение кожной складки, мм (М±m)

через:

через:

24 ч

48 ч

72 ч

24 ч

48 ч

72 ч

Клинически здоровые


1,0±0,1


1,0±0,1


0±0,0


1,3±0,1


1,2±0,1


1,0±0,1

Больные аспергиллезом


4,5±0,5


5,5±0,5


8,5±0,5


4,0±0,2


4,2±0,2


5,3±0,3

Больные кандидозом


1,0±0,2


1,0±0,2


0±0,0


1,3±0,1


1,2±0,1


1,1±0,1

Больные мукорозом


1,5±0,2


1,3±0,1


1,0±0,1


1,6±0,2


1,5±0,2


1,3±0,1

Больные невыясненной этиологии


1,0±0,1


1,0±0,1


0,5±0,1


1,0±0,1


1,0±0,1


0,5±0,1


Разработка способов лечения при аспергиллезе.

С целью поиска средств защиты животных от аспергиллеза было испытано влияние антигельминтиков на грибы рода Aspergillus. Было установлено, что вермокс, мебенвет и медамин из-за наличия в их составе активного компонента мебендазола не только задерживают рост грибов, но и обладают фунгицидными свойствами. При подтитровке наибольшую зону задержки роста аспергилл 30 мм обеспечивал медамин. Установлено, что для лечения животных больных аспергиллезом оптимальной ежедневной дозой является пероральная дача медамина из расчета 50 мг на 1 кг ж. м. При лечении телят и поросят 2- 4 месячного возраста в течение 7 дней выздоровление наступало у 100 % животных.


1   2   3


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница