Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения




Скачать 133.75 Kb.
Дата12.06.2016
Размер133.75 Kb.
«УТВЕРЖДАЮ»
Руководитель Департамента
государственного контроля качества,
эффективности, безопасности лекарственных
средств и медицинской техники МЗ РФ
_______________ Р.У. Хабриев
«05» января 2001 г.

 

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ


ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

альфа-ФЕТОПРОТЕИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА



(ИФА-АФП-1)

 

Рекомендована Комиссией по наборам реагентов


для иммуноферментного (неинфекционные),
радиоиммунологического и других видов
иммунохимического анализа Комитета
по новой медицинской технике МЗ РФ
(протокол № 10 от 20 ноября 2000 г.)

 

ВЗАМЕН ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ,



УТВЕРЖДЕННОЙ 16 июля 1997 г.

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов «ИФА-АФП-1» предназначен для количественного определения альфа-фетопротеина в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуно­ферментного анализа.

1.2. Альфа-фетопротеин (АФП) является гликопротеином с молекулярной массой около 70000 Да. В процессе развития человека АФП образуется главным образом в желточном мешке и эмбриональной печени и в меньшей степени в желудочно-кишечном тракте. АФП является главным белком сыворотки крови раннего плода. Своей максимальной концентрации (до 240000 МЕ/мл) в сыворотке крови плода АФП достигает в период 12...15 недель внутри­утробного развития, после чего его уровень снижается и достигает нормы (0...16 МЕ/мл) к концу второго года жизни. В таких пределах в норме этот показатель сохраняется на протяжении всей жизни.

АФП выделяется почками плода в амниотическую жидкость и оттуда через плаценту и пупочный канатик проникает в систему кровообращения матери. Уровень АФП в крови беременных женщин постоянно возрастает и достигает макси­мума (до 400 МЕ/мл) к середине третьего триместра беременности.

Изменение концентрации АФП в сыворотке крови беременных женщин является важным методом пренатальной диагностики некоторых врожденных заболеваний (открытые пороки медул­лярной трубы, синдром Дауна). Кроме того, этот метод широко применяется в акушерстве при диагностике множественной беременности, внутриутробной смерти плода и угрозе выкидыша. Определение уровня АФП также может быть использовано при диагностике и мониторинге различных видов рака. Так, например, высокий и удерживающийся уровень АФП (800... 80000 МЕ/мл и выше) очень часто сопутствует первичной гепатоме, тератомам семенников и опухолям эндодер­мального синуса яичников.

1.3. Набор «ИФА-АФП-1» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ при использовании всех стрипов одновременно.

Примечание: В случае дробного применения набор может быть использован в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

 

2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

В наборе «ИФА-АФП-1» использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуно­ферментного анализа. Для реалии­зации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к АФП. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-АФП-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация АФП, содержа­щегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-АФП-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации АФП. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству АФП в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропор­циональна количеству связанного антителами конъюгата анти-АФП-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация АФП в определяемых образцах.

 

3. СОСТАВ НАБОРА

· комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к АФП, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к АФП» — 1 пакет;

· калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Первому международному стандарту ВОЗ 72/225, содержащие известные количества АФП; концент­рации АФП в калибровочных пробах указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (по 0,5 мл);

· конъюгат анти-АФП-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е» — 1флакон  (14 мл);

· буфер для разведения образцов сыворотки крови, маркирован «Буфер Д2» — 1флакон (10 мл);

· концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1флакон (20 мл);

· раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14 мл);

· стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» — 1флакон (14 мл);

· контрольная сыворотка с известным содержанием АФП, маркирована «Контрольная сыворотка» — 1 флакон (0,5 мл).

 

4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА



4.1. Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции моноклональных антител к АФП с сывороточным альбу­мином, хорионическим гонадотропином, плацентарным лактогеном и иммуноглобулинами человека.

4.2. Коэффициент вариации результатов определения АФП в одном и том же образце с использованием набора «ИФА-АФП-1» не превышает 8%.

4.3. Линейность. Зависимость концентрации альфа-фето­протеина в образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д2 имеет линейный характер в диапазоне концент­раций калибровочных проб № 2–№ 6 и составляет +10%.

4.4. Точность. Данный аналитический параметр прове­ряется тестом на «открытие» АФП— соответствие измеренной концентрации АФП предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы №3. Процент открытия составляет 90–110.

4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно опреде­ляемая набором концентрация АФП в сыворотке крови человека не превышает 1 МЕ/мл.

4.6. В наборе «ИФА-АФП-1» значения концентраций калибровочных проб выражены в МЕ/мл. Для пересчета концентраций АФП в нг/мл значение концентрации в МЕ/мл следует умножить на 1,25.

4.7. Хук-эффект высоких концентраций. В наборах реагентов, основанных на «сэндвич»-принципе анализа, при высоких концентрациях аналита зависимость величины оптической плотности от концентрации становится обратно пропорциональной (так называемый хук-эффект высоких концентраций). При использовании набора «ИФА-АФП-1» хук-эффект не обнаружен вплоть до концентрации АФП 12500 МЕ/мл.

4.8. Клиническая проверка. Концентрация АФП у 200 здо­ровых доноров составила 0...14,4 МЕ/мл.

4.9. Рекомендуется в каждой лаборатории при исполь­зовании набора уточнить значения концентраций АФП, соответствующие нормальным.

 

 



5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концент­рациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР», Москва, 1981 г.

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством водопроводной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. производные крови человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбу­дитель инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые исполь­зуются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

5.7. Запрещается прием пищи, использование космети­ческих средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

 

6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ:

· спектрофотометр вертикального сканирования, позво­ляющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;

· прибор для встряхивания рамки со стрипами (термоста­тируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание со скоростью 500–800 об/мин при температуре +37°С;

· пипетки полуавтоматические одноканальные с изме­няемым объемом отбора жидкостей: на 5–50 мкл; 40–200 мкл; 200–1000 мкл; 1000–5000 мкл с наконечниками;

· пипетка полуавтоматическая восьмиканальная, позво­ляющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл, с наконечниками;

· цилиндр мерный, позволяющий отмерять 200 мл;

· стакан стеклянный вместимостью 300 мл;

· вода дистиллированная;

· бумага фильтровальная;

· перчатки резиновые или пластиковые.

 

7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА



7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.

7.2. Буфер Д2 готов к использованию.

7.3. Предварительное разведение исследуемых сывороток. Если значения АФП в исследуемых образцах по предва­рительным данным выше значения калибровочной пробы № 6, образцы следует развести Буфером Д2 в 100 и 5000 раз. Пример подготовки образца к анализу:

Образец № 1 (разведение в 100 раз): 990 мкл Буфера Д2 + 10 мкл исследуемого образца.

Образец № 2 (разведение в 5000 раз): 490 мкл Буфера Д2 + 10 мкл образца №1.

7.4. Стрипы. Перед вскрытием пакет необходимо выдержать при комнатной температуре (+18...25°С) в течение 30 минут. Открыть пакет и переставить на свободную рамку необхо­димое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.5. Промывочныйбуфер. Необходимое количество Буфера Р развести дистиллиро­ванной водой в 10 раз.

Например: 5 мл БуфераР + 45 мл дистиллированной воды.

Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5 суток. Оставшийся неиспользованным Буфер Р хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.6. Конъюгат анти-АФП-пероксидаза готов к использованию.

7.7. Раствор ТМБ готов к использованию.

7.8. Стоп-реагент готов к использованию.

 

8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА



8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры. На последней странице приведена схема проведения анализа.

8.2. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промар­кировать следующим образом:

А1, А2 — №1 для измерения величины оптической плот­ности раствора ТМБ;

В1, В2 — № 2 для калибровочной пробы № 1;

С1, С2 — № 3 для калибровочной пробы № 2;

D1, D2 — № 4 для калибровочной пробы № 3;

Е1, Е2 — № 5 для калибровочной пробы № 4;

F1, F2 — № 6 для калибровочной пробы № 5;

G1, G2 — № 7 для калибровочной пробы № 6;

H1, H2 — № 8 для контрольной сыворотки.

8.3. Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 100 мкл раствора конъюгата анти-АФП-пероксидаза.

8.4. Внести в соответствующие лунки по 20 мкл калибро­вочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20 мкл исследуемой сыворотки в дубликатах.

8.5. Инкубировать стрипы в течение 1часа при встряхи­вании в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавлять по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п.7.5, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5–10 сек. с последующим декантирова­нием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

8.7. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. Инкубировать стрипы в темноте в течение 20 мин.

8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 1–2 мин.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при 450 нм. Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плот­ности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В — среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы. В линейных координатах построить для калибровочных проб график зависимости В (ед.опт.плотн.) от концентрации АФП в калибровочных пробах (МЕ/мл).

Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В–BТ, где ВТ — среднее значение оптической плотности лунок А1 и А2.

Определить содержание АФП в пробах по калибровочному графику. В случае предварительного разведения образцов необходимо измеренную концентрацию АФП умножить на фактор разведения.

8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п.8.8, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение 20 минут при температуре +2...8°С.

 

9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА



9.1. Набор «ИФА-АФП-1» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток.

Срок годности набора — 12 месяцев.

В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:

· стрипы хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8°C в течение всего срока годности;

· калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить не более 1 месяца при темпе­ратуре +2...8°C;

· конъюгат анти-АФП-пероксидаза, раствор ТМБ и буферД2 после вскрытия флаконов хранить не более 1месяца при температуре +2...8°C;

· промывочный буфер, подготовленный к использованию, хранить закрытым не более 5суток при комнатной темпе­ратуре (+18...25°C);

· БуферР и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°C в течение всего срока годности.



9.2. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную, мутную сыворотку, а также сыворотку, содержащую азид натрия.

9.3. При использовании набора для проведения нес­кольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика, кроме этого рекомендуется определение концентрации альфа-фето­протеина в контрольной сыворотке.

9.4. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.5. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

По вопросам качества набора «ИФА-АФП-1» обращаться по адресу: 189650, г. Санкт-Петербург, п. Песочный, ул. Ленинградская, д. 70/4, тел/факс: (812) 596-67-80, или в ИГКЛС НЦ ЭГКЛС МЗ РФ по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д. 14А, тел. (095) 120-60-95.

По вопросам поставки набора «ИФА-АФП-1» обращаться по адресу: 357340 г. Лермонтов Ставропольский край, ул. Нагорная д.4А телефон/факс (87935) 3-77-28, 3-74-65 ООО «ВИАР»

СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

Стадия анализа
и реагенты

Номер пары лунок в соответствии с маркировкой по п. 8.2.

1

2

3

4

5

6

7

8

9–48

Конъюгат анти-АФП-пероксидаза, мкл



100

100

100

100

100

100

100

100

КП № 1, мкл



20















КП № 2, мкл





20













КП № 3, мкл







20











КП № 4, мкл









20









КП № 5, мкл











20







КП № 6, мкл













20





КС, мкл















20



СХ, мкл

















20

Инкубация №1

1 час, термостатируемый шейкер, +37°С

5-кратная промывка:
промывочный
буфер, мкл


300


300


300


300


300


300


300


300


300

Раствор ТМБ, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация №2

КT, темное место, 20 минут

Стоп-реагент, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Перемешивание

Шейкер, 1–2 минуты

Измерение ОП р-ров в лунках стрипов

Фотометр, 450 нм

Расчет результатов

Калькулятор и масштабная бумага
либо соответствующая компьютерная программа



Примечания:
КП — калибровочная проба;
КС — контрольная сыворотка;
СХ — анализируемые пробы;


ОП — оптическая плотность;
КT — комнатная температура (+18...25°С).


Инструкция составлена сотрудниками ЗАО «Алкор Био»:


зав. лабораторией биотехнологии В.А. Головаченко
и ген. директором, к.б.н. Д.Г. Полынцевым.


База данных защищена авторским правом ©uverenniy.ru 2016
обратиться к администрации

    Главная страница